Mikro-Tümplerforum

Liebe Tümpler,

Angeregt durch ein kleines Intermezzo in Michaels Thread zu den Bauchhärlingen möchte ich das Thema der Farbe in der Mikroskopie und bei der Bestimmung von Plankton hier einmal gesondert aufgreifen (seine tollen Berichte zu den Bauchhärlinge sollen hiervon unbeeinflusst besondere Aufmerksamkeit erfahren).

Zu dem Thema habe ich schon verschiedene Spezialliteratur gefunden. Hier ist jedoch Eure Erfahrung und Meinung gefragt.

Welche Rolle spielt die Farbe in der Mikroskopie?
Welche Rolle spielt die Farbe bei der Bestimmung der Arten?
Welche Beleuchtungen setzt Ihr ein und warum?
Wie geht Ihr das Thema in der Mikrofotografie an?

Es soll diskutiert werden!

Viele Grüße

Thilo

Ich mache einmal selbst den Aufschlag:

Mir fällt in der Praxis immer auf, dass Mikroskopoptiken unter bestimmten Lichtverhältnissen gelegentlich eine merkwürdige Farbwiedergabe bieten. Mikroskopobjektive verschiedener Serien und sogar innerhalb der gleichen Serien scheinen verschieden farbiges "Weiß" zu ergeben. Ich meinte ich bilde es mir ein, und verglich dann verschiedene Fotos mit den verschiedenen Objektive, um den Eindruck bestätigt zu finden.

Versilberte Ciliaten mit ihrem harten Kontrast sind selbst mit besseren Optiken immer besonders schwierige Kandidaten. Fotografien eines Objektmikrometers sind im Kamerabild mit manchen Optiken überraschenderweise nicht schwarzweiß, sondern "farbig". Manchmal sehen solch kontrastreiche Abbildungen einfach nur "braun" aus, obwohl die Probanden unter dem Mikroskop eher farblos (schwarz/weiß) erscheinen sollten.

Irgendwo fand ich die Frage eines Kollegen in einem Forum, wieso DIC Aufnahmen eines anderer Kollegen nie farbige Ränder zeigen. Antwort des Kollegen: Er retuschiert diese weg.

Welche Herausforderung habt Ihr wie gelöst? Stellt doch mal besonders knifflige Fälle als Foto hier ein und beschreibt Euer Problem oder Vorgehensweise.

Gespannte Grüße

Thilo

Hallo Thilo,

ein interessantes Thema, auch wenn ich bei meinen ungefärbten Gastrotrichen damit keine Probleme habe.

Letztendlich glaube ich, dass Farbe an sich keinen diagnostischen Wert hat. Erst der Vergleich zweier unterschiedlicher Farben unter den selben Aufnahmebedingungen hat eine physikalische Relevanz.
Das Problem fängt bei der Beleuchtung an: der Farbraum ist - mathematisch gesprochen - ein dreidimensionaler, linearer Vektorraum. Deshalb kann man jede Farbe mit drei beliebigen (linear unabhängigen) Farben zusammen mischen. Das bedeutet, dass die selbe Lichtfarbe aus völlig unterschiedlichen Spektren erzeugt werden kann. Die Reaktion der Objekte hängt also nicht von der Farbe des Beleuchtungslichtes sondern von dessen spektraler Zusammensetzung ab.
Der nächste Problempunkt ist die Optik, die je nach Material und Beleuchtungsspektrum selbst ohne Abbildungsfehler das transmittierte Spektrum verändert. Damit ist der Farbeindruck Kondensor- / Objektiv- / Okular-abhängig.
Dann haben wir die Empfindlichkeitskurve der Kamera (oder des Auges), das die Farbe wieder verändert. Hinzu kommt der Weißabgleich der Kamera (oder unseres Auge/Gehirns, der von dem Umgebungslicht abhängt).
Deshalb ist der Farbeindruck bereits bei völlig sauber justiertem Durchlicht abhängig von dem Mikroskop und dem Betrachter und nicht nur von den Eigenschaften des Objektes.
Wenn man jetzt noch irgend eine Methode der Kontrastverstärkung verwendet, wird das ganze noch beliebiger:
Bei schiefer Beleuchtung mischt man das transmittierte Licht mit den vom Objekt reflektiertem, die beide unterschiedliche spektrale Eigenschaften haben. Man kann den Einfallswinkel des Lichtes soweit erhöhen. bis man im Dunkelfeld nur noch das reflektierte (gestreute) Licht sieht: Die Farbe ist eine völlig andere als bei Transmission.
Phako und Dik verwenden Interferenz, die abhängig von dem Brechungsindex der Probe dazu führt, dass einzelne Wellenlängen ausgelöscht, andere verstärkt werden. Damit hat die Farbe mehr mit dem Brechungsindex der Probe als mit ihrem Absorptionsspektrum zu tun. Bei Dik kann man den Hintergrund auf ein neutrales Weiß einstellen, also einen Art Weißabgleich machen. Das behebt aber nicht das Problem, dass die Farben von den doppelbrechenden Eigenschaften des Objektes und nicht nur von den Absorptionseigenschaften abhängt.
Lange Rede, kurzer Sinn: Farbe an sich ist nicht genormt und ist bei jedem Mikroskop anders!
Letztendlich ist nur ein Vergleich der Farbe bei exakt gleichen Aufnahmebedingungen sinnvoll. Nur die Farbunterschiede sind physikalisch relevant. Der Rest ist eine Frage der Ästhetik.

Viele Grüße

Michael

Hallo Michael,

Du hast Recht mit der mathematische Beschreibung der Farbkalibration. Die drei (oder mehr) Grundfarben werden Sinne eines 3-dimensionalen (oder mehrdimensionalen) Vektorraums ausgedrückt als ein Farbtupel oder Vektor (R, G, B). Dahinter steckt eine Menge lineare Algebra (Matrizen-Transformation) und auch nicht-lineare Korrekturterme, die auch verschiedene Farbtemperaturen umzurechnen imstande sind.

Meinst Du mit Beliebigkeit die Methode der gewählten Farbkalibration in der Mikrofotografie?

Ich persönlich glaube, dass das Gegenteil der Fall ist: Farbe ist nicht beliebig, ist genormt, es gibt eine Reihe internationaler Standards und Normen, deren erforderliche Bearbeitung aktuell diskutiert wird. Und die Farbe hat in der Mikroskopie offenbar auch einen hohen Stellenwert. Diese Arbeit fiel mir vor einiger Zeit als erstes ins Auge:

Bautista, Pinky A., Noriaki Hashimoto, and Yukako Yagi. "Color standardization in whole slide imaging using a color calibration slide." Journal of pathology informatics 5 (2014).

Hier werden einige mathematische Grundlagen dargestellt und auch ein Praxisbeispiel zur Farbkalibration des Detektors für histologische Präparate. Ich habe unten eine Abbildung aus dieser Arbeit reproduziert, die solch ein Testpräparat illustriert, das man sich prinzipiell selbst bauen kann. In der Illustration des komplizierten Workflows sind alleine schon vier standardisierte Farbräume dargestellt: sRGB, RGB ("raw"), CIE XYZ und LAB.

Ein Weißabgleich in der modernen Digitalkamera arbeitet prinzipiell ähnlich, orientiert sich jedoch an gefundenen (besser: vermuteten) Weißtönen im Bild selbst.

Die oben genannte Arbeit geht einen Schritt weiter und fragt nach der korrekten Wiedergabe der Farbvektoren selbst. Diese sind im Rohzustand nicht orthogonal, sondern irgendwie linear abhängig. Man kann auch sagen, dass rohe R, G und B Werte nicht rein sind, in die normalen "Farbrichtungen" Rot, Grün und Blau weisen, sondern "schief" stehen, also Mischfarben ausdrücken. In dieser linearen Abhängigkeit drückt sich quasi eine nicht zufrieden stellende Farbwiedergabe mathematisch aus, die gerade zu rücken ist. Man muss da also mit dem mathematischen Hämmerchen die Nägel wieder gerade biegen.

Du hattest das oben schon erwähnt und so ausgedrückt: "Das bedeutet, dass die selbe Lichtfarbe aus völlig unterschiedlichen Spektren erzeugt werden kann."

Viele Grüße

Thilo

Hallo Thilo,

Du hast natürlich Recht - Farbe kann gemessen werden und es gibt eine Reihe von Normen, wie dies zu erfolgen hat, um vergleichbare Messwerte zu erhalten. Das meine ich nicht, wenn ich sagte, dass die Farbe eines Objektes nicht genormt ist. Farbe ist keine Materialeigenschaft und wird erst durch die Beleuchtung / Optik / Bildverarbeitung (in der Kamera oder dem Gehirn) erzeugt und ist deshalb nur dann für das Objekt charakteristisch, wenn sie unter gleichen Bedingungen erzeugt wird. Eine Kalibrierung kann meines Erachtens für verschiedene Mikroskope nur an einzelnen Punkten im Farbraum erfolgen. Wie weit der Kalibrierungsbereich geht, hängt wieder davon ab, wie ähnlich die Aufnahmebedingungen und das zu beurteilende Objekt sind. Dies ist sicherlich möglich und nötig für die routinemässige Beurteilung von gefärbten Gewebeschnitten in der Histologie. Hier kann man sich dann auf ähnliche Objekte mit ähnlicher Farbe, beurteilt durch Mikroskope mit ähnlicher Beleuchtung beschränken - nicht umsonst vermeiden Histologen soweit ich weiß immer noch LED-Beleuchtung.
Die optischen Eigenschaften eines Objektes (frequenzabhängige Transmission, Absorption, Reflexion, Brechungsindex - also letztendlich der frequenzabhängige Leitfähigkeitstensor) legen nicht die Farbe des Objektes fest. Die Farbe wird erst durch die Beleuchtung, Optik etc. erzeugt und ist deshalb vom Mikroskop abhängig. Da z.B. der Frequenzgang der Beleuchtung von Mikroskop zu Mikroskop (gerade bei LED) unterschiedlich ist, ist die Objektfarbe nicht spezifisch für das Objekt.

Machen wir ein Gedankenexperiment:
Bei einem Mik soll die Beleuchtung aus drei monochromatischen Linien (RGB) bestehen, deren Intensität so abgestimmt ist, dass das Licht weiß ist. Wenn das Objekt jetzt zwei dieser Linien absorbiert (z. B. R&G) erscheint die Farbe des Objektes jetzt rein B. Bei einer ähnlichen Beleuchtung, deren drei "Grundlinien" nur leicht in der Frequenz verschoben sind, würde das Objekt nichts absorbieren, so dass das Objekt hier rein weiß erscheinen würde. Das ist natürlich ein pathologischer Fall und niemand würde eine solche Mikroskopbeleuchtung verwenden. Aber das Beispiel verdeutlicht zwei Dinge:

• Die Farbe des Objektes ist abhängig von der Beleuchtung
• Unterschiedliche Objekte reagieren unterschiedlich empfindlich auf die Eigenschaften der Beleuchtung. Zwei Objekte können in Abhängigkeit von der Beleuchtung die selbe Farbe oder auch eine unterschiedliche haben.

Eine Kalibrierung kann deshalb nicht alle Objekte und alle Beleuchtungsvarianten abdecken.
Noch schlimmer wird es, wenn man die Farben, die von verschiedene Kontrastierungsverfahren erzeugt werden, miteinander vergleichen will. So ist z. B. bei DIK die Farbe nicht nur von der Doppelbrechung abhängig, sondern auch noch von der Orientierung der Objekte relativ zur Pol-Richtung. Zellwände von Algen haben in die eine Richtung eine andere Farbe als senkrecht dazu.

Da Farbe keine Objekteigenschaft ist, ist sie in meinen Augen nicht eindeutig festzulegen. Wie man die Farbe wählt, ist für mich nur eine Frage der Ästhetik und der bevorzugten Sehgewohnheiten. Ich glaube nicht, dass es möglich ist, Grünalgen und "goldene" Diatomeen im selben Foto auf verschiedenen Mikroskopen so abzubilden, dass sowohl das Grün als auch das "Goldbraun" immer gleich erscheint.

Viele Grüße

Michael

Es ist ja noch schlimmer.

Aber auch das folgende Beispiel einer Fotografie mit einem früher restaurierten Mikroskop verdeutlicht einige "Farbprobleme". Ich habe es früher einmal in einem Vortrag zur digitalen Fotografie gezeigt. Die Farbkorrektur des unteren Beispiels ist sicherlich gut, aber die Kamera, hier ein Handy, saß schief genug auf dem Okular, um durch unerwünscht "schiefe" Beleuchtung - ich meine nicht die schiefe Beleuchtung im Tümpelbereich - eine einseitige, chromatische Aberration der Endlichoptik dieses alten schwarzen "Standard Junior" zu provozieren.
Schritt für Schritt lassen sich meiner Meinung nach solche Dinge natürlich schon korrigieren.

Die LED-Phobie in der Mikroskopie halte ich im Prinzip für unbegründet oder zumindest überbewertet und ebenfalls rein subjektiv.

Von der Physik her beleuchtet führt der Einsatz von Halogenlampen zu einem unausgewogenen Kamerabild. Denn eine Halogenlampe hat eine niedrige Farbtemperatur und liefert zudem unerwünschtes infrarotes Licht (das einige Kamera obendrein leider aufzeichnen). Während der so überbelichtete Rotanteil einer Halogenlampe wenig verrauscht erscheint, ist im blauen Farbkanal ein deutliches Rauschen aufgrund geringerer Intensität im blauen Spektrum der Halogenlampe in den Farbkanälen zu finden. Denn im Blauen kommen deutlich weniger Lichtquanten auf dem Sensor an, WEIL die Halogenlampe so eine geringe Farbtemperatur aufweist. Die Farbkorrektur der Kamera kann die farbliche Unausgewogenheit der schmutzig-braunen Halogen-Beleuchtung korrigieren, nicht jedoch die Rauschterme. Mit anderen Worten: Bei solch farblich unausgewogener Beleuchtung, wie mit einer Halogenlampe, werden die Rauschgrößen prinzipiell durch die Farbkorrektur der Kamera verstärkt. Daher ist eine tageslicht-weiße LED (Farbtemperatur um 6000-7000K) für die Fotografie sicherlich besser geeignet, als eine Halogenlampe.

Setzt man nun Blaufilter ein, um das zu kompensieren, gerät das Spektrum auch in eine Schieflage und wird "verbeult". Hierbei sinkt obendrein die Gesamtintensität. Und in der Fotografie belebter Tümpelproben wissen wir, dass wir nicht genug Licht haben können.

Einige Mikroskopiker versuchen dem Verlust des Lichts durch Blitzen zu entgegnen. Leider haben diese Xenonlichter ein ebenfalls unausgewogenes Lichtspektrum, da hier auch diskrete Linien im Licht einer Gasentladungsröhre zu finden sind und kein kontinuierliches Spektrum vorhanden ist, das dem Sonnenlicht ähnelt. Demgegenüber scheint eine weiße LED mit ihrer berüchtigten "Grünlücke" geradezu ein perfektes Licht zu liefern. Wie solch ein Spektrum einer Gasentladungsröhre aussehen kann, ist hier nachzulesen: Breitbandkalibration mit Xenon Stroboskoplampe. Dennoch würde kein professioneller Fotograf an der Wirksamkeit eines Blitzes zweifeln oder dessen Farbwiedergabe in Frage stellen. Die speziellen LEDs für die Mikroskopie, die ich oben erwähnte, liefern demgegenüber übrigens ein ausgewogeneres Lichtspektrum. Schlimmer wird es jedoch, wenn man nun mit einer "warmen" LED mit einer niedrigen Farbtemperatur das Licht der Halogenlampe versucht zu imitieren.

Das Thema LED hat also schon einige Facetten, die man darstellen müsste.

Da sind wir aber nur bei der reinen Physik.

Vor einigen Jahren habe ich mit meinem Mikroskop einen Test mit einer Kieselalge mit verschiedenen Beleuchtungen gemacht.

Die modernen Zeiss Axio Serien setzen Halogenlampen mit GU5.3 Sockel ein (typ. 35 W) mit Abstrahlwinkel 10° ein. Diese können alternativ gegen eine 12V LED mit gleichem Sockel (GU5.3) getauscht werden. Lichtquellen sind daher einfach auszuprobieren. Es standen für den Test zur Verfügung:

• OsramHalogenlampe 35W (links oben, Originalzubehör)
• 3W LED "kaltweiß" (Farbtemperatur 4600 K) mit Abstrahlwinkel 38°(Baumarkt, "no name")
• 3W LED "kaltweiß" (Farbtemperatur 6000 K) mit Abstrahlwinkel 20°(Zubehör)
• 4W LED "tageslichtweiß" (Farbtemperatur 7000 K) von Barthelme mit Abstrahlwinkel 10° (Conrad, leider nicht mehr erhältlich)

Die Testaufnahmen einer Kieselalge wurden mit Phasenkontrast gewonnen, einer Methode, einer ohnehin Licht schluckenden Technik.

Die Aufnahmen wurden mit automatischem Weißabgleich meiner damals verwendeten Canon Kamera gemacht. Dabei sollte man sich von Herstellerangaben wie "kaltweiß" nicht irritieren lassen, denn die Farbtemperatur dieser LEDs kann deutlich hin zum Rot tendieren. Die beiden 3W LEDs aus dem Baumarkt schneiden hier am schlechtesten ab. Aufgrund des großen Abstrahlwinkels gelangt bei vergleichbarer Leistung weniger Licht in das Präparat. Entsprechend ist das Bildrauschen hier recht groß. Die Farbwiedergabe der originalen (mitgelieferten) 35W Halogenlampe leidet trotz automatischem Weißabgleich unter einem Rotstich und einem vergleichsweise hohen Rauschen. Nach meinem Eindruck entspricht die Abbildung der sehr hellen 4W LED mit Farbtemperatur 7000 K am ehesten dem, was man im Mikroskop tatsächlich farbig sehen konnte.

Ich lasse die Abbildung hier ohne weitere Kommentierung stehen.