Mikro-Tümplerforum

Liebe Freunde des Tümpelns,

dieser Bericht aus dem großen Forum ist hier vielleicht auch interessant - es ging primär um technische Aspekte der Blitzfotografie, die mich jedoch veranlasst haben, den Ciliaten Spirostomum genauer zu untersuchen. Kann ihn jemand bis zur Art bestimmen?

Danke und viele Grüße

Ole

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Liebe Kollegen,

wir hatten hier http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=27203.0 eine interessante Diskussion zum Thema "Blitzfotografie" mit Canon EOS-Kameras und zur Frage, ob eine spiegelschlagfreie Fotografie im Live View Modus möglich ist, um z.B. empfindlich reagierende, kontraktile Ciliaten zu dokumentieren. Der Faden führte zahlreiche interessante technische Details zutage, wobei mir nicht mehr ganz klar ist, ob Jons Eingangsfrage für ihn geklärt ist. Da ich mein - möglicherweise etwas handgestricktes - Verfahren vorgestellt hatte, möchte ich noch mit einigen Ergebnissen zeigen, was damit in der Praxis machbar ist. Eine meiner Moorproben zeigt gerade eine Massenentwicklung des Ciliaten Spirostomum, also eines durchaus hochkontraktilen, sensibel reagierenden Ciliaten, der sich für einen Test anbot.

Im Telegrammstil hier die Aufnahmeparameter: Zeiss Standard WL, Canon EOS 700D adaptiert über 40mm Canon Pancake, 10x KPL-Okular, Stahlschmidtscher Blitzwürfel auf der Lichtaustrittsöffnung, ISO 100, Blitz "manuell" auf Intensitäten von 1/16 - 1/4 der maximalen Leistung eingestellt, Fokussierung über klappbaren Kamera-Monitor, Pilotlicht vor Auslösen stark reduziert (visueller Einblick im Okular: Objekt schwach erkennbar), einfache Zeiss Plan Achromaten 16/0,35 und 40/0,65, DIK Zeiss-endlich "neu" mit den passenden Schiebern.

Hier mehrere Übersichtsaufnahmen mit dem 16er Objektiv. Die Dichte der Ciliaten um die Detritusflocken und Reste der Moosblättchen ist enorm. Die Länge der adoralen Membranellenzone (adM) entspricht ungefähr 1/3 der Gesamtlänge der Zelle, der Makronukleus ist oval.



Ab jetzt Detailaufnahmen mit dem 40er Objektiv, links oben ein Exemplar mit dem Mundbereich, ein anderes mit dem Hinterende der Zelle (adM=adorale Membranellen, kV=kontraktile Vakuole). In der unteren Darstellung ist besonders deutlich der Zellmund erkennbar (Cyst=Cytostom).



Unterhalb der Pellikula findet man eine auffallende Punktierung, die in Längsreihen schräg zur Längsachse der Zellen verläuft (spG=subpellikuläre Granula). Sind dies Basalkörper von Cilien oder eventuell Mitochondrien?



Zum Schluss noch eine Darstellung, die den lang gezogenen Mundspalt bis zum Zellmund zeigt. Neben den adoralen Membranellen erkennt man hier auch die eher schütteren Cilienbänder, die in schrägen Längsreihen die Zelle überziehen.



Mich würde sehr interessieren, ob man mit HD-Filmen und der Auswahl einzelner Bilder daraus ähnliche Ergebnisse bekäme und das Blitzen damit überflüssig wäre.

Viele Grüße

Ole

Hallo Ole,

im vergangenen Jahr hatte ich um diese Jahreszeit auch massenhaftes Auftreten von Spirostomum in einem Kleingewässer registriert. Makroskopisch sah es aus wie Pollen. Da diese für die jahreszeit eher ungewöhnlich erschienen, nahm ich eine Probe. Ich fand die üblichen drei Arten von Spirostumum so dicht, wie ich bislang nur Paramecium in Kultur fand: in dichten, makroskopisch gelb erscheinenden Wolken. Sie mögen wohl Kleingewässer mit viel Falllaub.

Deine Aufnahmen sind von hervorragender Qualität. Mit der DSLR nehme ich oft Videoaufnahmen auf. Jedoch bleibt die Bildqualität weit hinter denen einzelner RAW Fotografien mit der DSLR zurück. Daher bin ich wieder dazu übergegangen Belegfotos anhand von Einzelbildern mit einer sehr hellen 4W LED aufzunehmen, die Belichtungszeiten von 1/1000 s bei ISO 100 gestattet. Derart helle Beleuchtung schadet auf Dauer jedoch den Probanden in ähnlicher Weise wie helles Fluoreszenzlicht und das Licht ist zu hell für visuelle Beobachtung, so dass nur mit dem Monitor fotografiert werden kann.

Da die Arten meist in Gesellschaft mehrerer Arten auftreten und ich bislang keine Art einzeln fand, ist für die sicher Bestimmung in solch einem Gewimmel zunächst wichtig zu klären, ob die Bilder vom gleichen Individuum stammen, oder nicht. Es ist hier besser einzelne Individuen zu isolieren und Fotos anzufertigen. Fast könnte man meinen, es handle sich gar nicht um verschiedene Arten, da sie meist in Gesellschaft daher kommen.

Unterschiede sind zunächst in der Größe zu finden. Aber es kann auch Artefakte und gerade erfolgte Teilung eine solche Eingrenzung der Art schwer machen. Die Lage des Mundfelds relativ zu den Körperenden (mittig oder nicht) und Länge der von Dir abgebildeten adoralen Membranellen Zone ist ein Merkmal der Unterscheidung bei Sp. ambiguum und Sp. minus. Man muss hier das Verhältnis der Länge der Membranellenzone zur Körperlänge bestimmen. Laut Foissner beträgt es für Sp. ambiguum 65-75%, für Sp. minus nur 35-50%. Aber auch hier können gerade erfolgte Teilung einen Strich durch die Rechnung machen und schon die Varianz lässt ggf. Probleme in der Bestimmung erkennen. Auch Formvarianz scheint laut Foissner Probleme zu machen. Am Besten man nimmt die größeren Exemplare für eine Auswertung. Die Form und Größe der Vakuole ist ebenfalls ein Merkmal.

Sp. ambiguum hat einen langen in viele, zusammenhängend in Knoten gegliederten Macronucleus, der sich fast über die gesamte Körperlänge zieht (wie eine Wurstkette). Für Sp. minus gibt Foissner einen "rosenkranz-förmigen" Macronucleus an, den ich ebenfalls als Wurstkette beschreiben würde. Dass die einzelnen Nucleus-Segmente über eine Membran zusammenhängen kann man mit Schwierigkeit im Lichtmikroskop, besser im Phasenkontrast und in Fluoreszenz erkennen. Spirostomum caudatum hat einen(!) ellipsoiden Macronucleus, jedoch ein merkwürdig verlängertes Schwanzende. Sp. teres hat wieder einen(!) einzigen ellipsoiden Macronucleus. Sp. caudatum habe ich noch nicht bewusst gesehen. Sp. minus hat eher gerade nach hinten verlaufende Cilienreihen. In gequetschter Form können die Cilienreihen wohl bei allen Arten spindelförmig gewunden erscheinen.

Ich sehe bei einigen Deiner Aufnahmen, nicht jedoch allen, einen ellipsoiden Macronucleus. Daher tippe ich auch hier auf mehrere Arten. Im Hellfeld verwechselt man die Nuclei gerne mit dominierenden Phagosomen, vor allem nahe der Mundregion, bei der sich neu entstandene Phagosome gerade abgeschnürt haben. Bei Spirostomum habe ich die Erfahrung gemacht, dass der Nucleus eben gerade nicht so dominant hervortritt, wie es den Anschein hat. So muss man einige Erfahrung sammeln, um etwa die "Wurstkette" bei Sp. ambiguum oder Sp. minus zwischen den oft auch dunkel gefüllten Phagosomen unterscheiden zu lernen. Hier hilft nur Kernfärbung in Fluoreszenz, es sei denn der Nucleus tritt einzeln deutlich hervor. In Deinem Fall meint man eine einzelne Art zu sehen, sicher wäre ich mir aufgrund meiner Erfahrung jedoch nicht.

Es könnte Sp. teres sein, für den Foissner jedoch einen Macronucleus mit 1-2 Micronuclei im hinteren Drittel angibt (was seinen abgebildeten Zeichnung im Ciliatenatlas übrigens widerspricht). Daher bin ich mir wieder nicht sicher bezüglich der sicheren Identifikation des "einzelnen" Macronucleus in Deinen Aufnahmen. In Deinem Fall scheint der "Ma" eher mittig lokalisiert und daher die lichtmikroskopische Identifikation nicht sicher. Man könnte neben dem dominanten ellipsoiden "Ding" in der Mitte auch eine Wurstkette bei einigen Exemplaren wähnen. Wie gesagt, letztlich hilft nur Fluoreszenz den Macronucleus gut zu identifizieren. Notfalls mit Acridinorange, welches leider auch Phagosomen färbt, besser mit Hoechst 33342 oder DAPI. Ich denke lichtmikroskopische Färbung vertragen diese Ciliaten leider nicht.

Versilbern oder fixieren lassen sie sich erfahrungsgemäß leider nicht gut. Mein Fund im Herbst/Winter letzten Jahres litt sogar an spontanem Zerfall unter Deckglas nach wenigen Minuten, was sich auch nach zwei Wochen im Labor nicht änderte. Die gleichen Arten aus einem Warmwasseraquarium heraus kultiviert zeigen sich hier regelmäßig sehr viel robuster und ließen sich auch mehrere Tage mit Fluorochromierung kultivieren.

Von daher tendiere ich zu Sp. minus mit "Beifang", trotz des vermeintlich(!) dominanten Macronucleus.

Mit der Idee von Mitochondrien liegst Du übrigens nicht falsch. Diese zeigen sich bei Ciliaten in Fluoreszenz mit Rhodamin 123 oder Rhodamin 6G oft entlang der Cilienreihen gruppiert - sofern die Färbung überhaupt gelingt.

Gruß

Thilo

Hallo Thilo,

ich danke Dir herzlich für die ausführliche Kommentierung - ich habe darauf hin heute auch noch den Foissner gesichtet und würde mich Deiner Einschätzung (wahrscheinlich S. teres) anschließen. Gestern abend konnte ich bei erneuter Beobachtung eindeutig die 1-2 kleinen Mikronuklei direkt an den Makronukleus angeschmiegt liegend identifizieren. Alle weiteren Exemplare zeigten ebenfalls den elliptischen Makronukleus; bei keinem Exemplar war der MN perlschnurartig.

Wenn Du eine Fluoreszenzfärbung eines Kernes einer Spirostomum-Art geschafft hast, würde mich ein Bild sehr interessieren. Aber Du schriebst ja, die Zellen machten dabei Probleme ...

Viele Grüße

Ole

Hallo Ole,

auf die Schnelle hatte ich nur ein vorbereitetes, verkleinertes Bild gefunden, welches leider nur eine grobe Übersicht bietet. Es gibt noch andere auf meinem Server. Ich liefere gerne noch weitere Aufnahmen nach, bitte um Geduld, diese entsprechend aufzubereiten.

Aber es verdeutlicht, dass der Kern gelegentlich nur schwer zu erkennen ist (hier: Phako) und auch in Fluoreszenzfärbung mit Acridinorange die Phagosome bisweilen deutlicher erscheinen. Dieser Effekt ist der Kernmembran geschuldet, die eine effiziente Barriere auf für DNA Fluorochrome darstellen kann. Die Acridinorange Färbung ergibt manchmal jedoch auch Färbungen der Cilienreihen. Nicht nur Mitochondrien sind hier zu finden sondern auch andere, saure Organellen an der Basis der Cilien. Ich sehe, dass ich Aufnahmen von Spirostomum finde, die das belegen und auch mehr Details des zusammenhängenden, perlschnurartigen Macronucleus dieser Art zeigen, sehr wahrscheinlich Sp. ambiguum in diesem Fall, was ich aufgrund der Länge der adoralen Membranellenzone schließe. Man beachte, dass Phagosome ebenfalls eher in der Mitte des Körpers angeordnet sind, während der Ma fast über die ganze Zelle verteilt ist und zudem zwei "leere" Räume in der Zelle das Vorhandensein zweier Macronuclei vortäuschen.

Das verwendete Objektiv war ein 10x/0.25 Ph1, um den ganzen Ciliaten abzubilden. Dabei gehen leider viele Details der Cilien und des Mundfeldes verloren. Es sind übrigens zwei Standbilder aus einer Videosequenz, die ich mit meiner Canon EOS 60D aufgenommen habe. Dabei wurde von Phako nach Fluoreszenz umgeschaltet.

Gruß

Thilo

Was mich an Deinen Aufnahmen noch irritiert: Foissner muss Gründe gehabt haben, darauf hinzuweisen, dass bei Sp. teres 2-3 Reihen des Wimpernfeldes, Sp. ambiguum jedoch 4-5 Reihen der Granula besitzt. Auch in Deinen Aufnahmen sind 4-5 Reihen zu erkennen, was mich wieder zu einem eventuell falsch interpretierten Ma führt oder doch einem Mix aus mehreren Arten.

Hier noch die versprochenen Fluoreszenzaufnahmen vom November 2015. Mich fasziniert vor allem, dass die Fluoreszenz einen derart räumlichen Eindruck von den Ciliaten vermittelt, wie es sonst keine lichtmikroskopische Technik zu zeigen vermag.

Daten:

Doppelfärbung mit Acridinorange und Hoechst 33342, Videoaufnahmen mit der Canon EOS 60D am AxioLab.A1 FL-LED.

1. Blauanregung, Acridinorangefärbung der Organellen des Wimpernfeldes nahe des Zellmunds.

2. UV-Anregung + Phako eines zerdrückten Exemplars. Der zusammenhängende Macronucleus ist blau gefärbt.

Hallo Thilo,

vielen Dank für die Mühen mit den neu eingestellten Bildern. Hinsichtlich der Bestimmung gebe ich Dir vollkommen recht - ich habe inzwischen mit der Ölimmersion eingeklemmte Exemplare mikroskopiert und zählte auch 4-5 Reihen an Granula.

Ganz naive Frage vorab: Ist Phagosom der Fachausdruck für Nahrungsvakuole?

Dass man den Kern bei der Mikroskopie im Phasenkontrast häufig nicht richtig erkennen kann, wundert mich nicht (siehe Dein Foto mit dem 10:1-Phako-Objektiv). Dafür sind Ciliaten, zumindest im nicht gepressten Zustand, einfach zu dick und bewirken gegenüber dem Beleuchtungsstrahl, der durch das Medium streicht, zu große Gangunterschiede. Die Folge sind Halo-Erscheinungen und konfuse Linien. Hierfür braucht man DIK, der auch mit größeren Gangunterschieden gut klar kommt. Der Phako ist dann wieder sehr gut und empfindlich, wenn die Strukturen dünn oder stark gepresst sind - siehe Dein letztes Bild.

Bei aller Ästhetik und dem technischen Reiz der Fluoreszenzabbildungen bin ich mir nicht so sicher, was ihr praktischer Nutzen in der Mikroskopie und Bestimmung von Ciliaten ist (nicht, dass ich von mir behaupten könnte, ich hätte auf diesem Gebiet besondere Erfahrung). Lassen sich nicht alle relevanten Details am besten im normalen Durchlichtmikroskop, idealerweise mit DIK, untersuchen, vorausgesetzt, die Objekte werden durch kontrollierten Deckglasdruck immobilisiert und liegen zum Schluss gepresst vor, so dass dann die Makro- und Mikronuklei zweifelsfrei beurteilt werden können?

Viele Grüße

Ole

Hallo Ole,

ja, in der englischen Literatur wird die Nahrungsvakuole als phagosome bezeichnet. Ich habe mir angewöhnt diesen auch in der deutschen Literatur verwendeten Begriff auch im Deutschen zu bevorzugen. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie kann man übrigens recht schön beobachten, wie deren Membran zunächst von anderen, kleineren Organellen gebildet wird, dort wo ein neues Phagosom am Zellmund abgeschnürt wird.

Im Hellfeld oder allgemein im Lichtmikroskop sehen wir nur solche Phasenobjekte. So wie Deine Frage, ob die gefundenen Organellen Basalkörper oder Mitochondrien sind, mit einem eindeutigen Jein zu beantworten ist. Mit dem DIC alleine kann dies niemals zweifelsfrei geklärt werden. Die Frage, ob ich ein beliebiges Organell, sei es auch nur ein Nucleus, vor mir habe, würde ich nicht alleine anhand einer lichtmikroskopische Aufnahme bewerten wollen. Auch in der Literatur ist schon länger die Färbung der Nuclei zur zweifelsfreien Darstellung insbesondere neuer Arten empfohlen (z.B. mit Methylgrün). Diese Vitalfärbung führt leider rasch zum Zelltod, da die verwendeten Farbstoffe für die Lichtmikroskopie im Gegensatz zur Fluorochromierung viel höher dosiert werden und dann als Zellgift wirken. Hier bietet die Fluoreszenz weitaus bessere Möglichkeiten, die Organellen in lebenden Zellen zu beobachten.

Bestes Beispiel sind die oft gelesenen "Öltröpfchen" oder Leukoplasten in Zwiebelzellen. In der Tat sind Mitochondrien lichtmikroskopisch (va. im Phasenkontrast) zu beobachten, auch bei Ciliaten. Auch im Fall der Zwiebel kann man Mitochondrien lichtmikroskopisch mit Phako, DIC oder schiefer Beleuchtung beobachten. Die Färbung von Zwiebelhautzellen mit verschiedenen Fluorochromen, welche Mitochondrien färben, lassen gelegentlich sogar andere Membranen gefärbt erscheinen, welche eher dem endoplasmatischen Reticulum zuzuordnen sind und manchmal fälschlich als große Mitochondrien interpretiert werden. Beide Strukturen lassen sich lichtmikroskopisch (vor allem im Phasenkontrast) darstellen, stellen jedoch unterschiedliche Organellen in der Zelle dar.

Bei den Ciliaten sind mikrostrukturelle Unterschiede im Erscheinungsbild der Organellen ebenfalls an der Tagesordnung, und auch die Fluoreszenzfärbung liefert nicht immer die gleichen Resultate. Je nachdem wie die Ciliaten "drauf" sind oder ob wir Mutationen vor uns haben.

Entlang der Cilienbasis sind verschiedene Organellen vorhanden, darunter auch Mitochondrien. Lediglich bei einigen Ciliaten konnte ich Mitochondrien bisher auch mit ciliären Strukturen übereinstimmend vorfinden. Meist sind Mitochondrien jedoch eher gleichmäßig in der Zelle verteilt mit einer eher auffälligen Konzentration um den Zellkern, mit dem sie in Wechselwirkung stehen.

Die von Dir gezeigten ciliären Strukturen, lassen sich bei einigen Heterotrichen, Oxytrichen und Euplotiden, wie in meinen Aufnahmen gezeigt auch mit Acridinorange (AO) färben. Spirostomum gehört auch in diese Kategorie. Für Paramecium wurde diese spezielle Färbung des Acridinorange in der Literatur zuerst beschrieben und mit den Trichocysten in Verbindung gebracht. Ironischerweise kann ich dieses Färbeergebnis für Paramecium bislang nicht bestätigen. Die Färbung mit AO ist untypisch für Mitochondrien, welche von Acridinorange nicht gefärbt werden. Einen ausführlicheren Review über die Färbung mit Acridinorange habe ich letztes Jahr im Mikroskopie Journal veröffentlicht.

Um welche Organellen genau es sich handelt, konnte ich noch nicht zweifelsfrei klären, da generell alle sauren Organellen, auch Phagosome in Frage kommen. Für Paramecium haben andere Autoren solche Organellen mit dem Elektronenmikroskop untersucht und ihnen einen neuen Namen gegeben: Acidosome. Gelegentlich tritt diese Färbung mit UV Anregung auch gelblich bis rot hervor (siehe zweite Aufnahme). Dies spricht für membran-umschlossene Organellen mit einem sauren pH im Inneren. Der Grund ist die leicht basische Eigenschaft des AO und der Umstand, dass es auch in einer protonisierten Form vorliegen kann und einige Zellmembranen in dieser Form nur in einer Richtung passieren kann (also nicht frei diffundiert). So reichert es sich in sauren Organellen an und fluoresziert durch höhere Konzentration allmählich rot, wie der ungelöste Feststoff des kristallinen AO. Das sieht man recht gut im Vergleich der beiden Fluoreszenzaufnahmen.

Da man weiß, dass Varietäten bzw. Mutationen oder "Stämme" verschiedener Ciliaten aufgrund veränderter Biochemie oder des inneren Aufbaus der Organellen sehr unterschiedliche Färbungen mit bestimmten Fluorochromen, wie Acridinorange, ergeben, ist die Fluorochromierung neben der Genanalyse die einzige Methode, diese Mutationen auf einfachere Weise zu differenzieren.

So muss die Folgerung lauten, dass gezielte Fluorochromierung zu einer besseren Bestimmung einer Art führen wird.

Gruß

Thilo

Hallo Ole,

ergänzend zu Thilos Ausführungen, sollte man bedenken, dass jede mikroskopische Abbildungsmethode eine andere physikalische / chemische Eigenschaft des Objekts kontrastiert: "normales" Hellfeld die Absorption, DIK den Gradienten des Brechungsindex, Phako den Brechungsindex, Pol die Doppelbrechung, Färbung mit Methygrün DNA, Färbung mit Janusgrün die Mitochondrien, TEM die Elektronendichte etc.
DIK ist deswegen so ansprechend, weil es - ähnlich dem Auge - gegenüber Absorption und Änderungen des Brechungsindex an Grenzflächen empfindlich ist. Es ergibt daher Bilder, die uns als sehr natürlich erscheinen (auch wenn das streng genommen nicht zutrifft). Aber um z.B. zu klären, ob eine Struktur ein Mitochondrion ist, sollte man eine andere Methode (Fluoreszenz od. Färbung) wählen, auch wenn das Ergebnis dann vielleicht nicht so ansprechend aussieht.

Schönes Wochenende

Michael

Hallo Thilo und Michael,

danke für Eure Ergänzungen.

Viele Grüße

Ole