Hallo Thilo,
Die Fxiertung lehnt sich grundsätzlich an folgendes Protokoll an:
https://electron-microscopy.hms.harvard ... reparation
Aber es gab ein paar Abweichungen.
Das Fixans wurde zunächst wie folgt angesetzt:
4% Formaldehyde + 2% Glutaraldehyd in 100mM buffer
Diese Stammlösung habe ich dann mit feingefiltertem Fundortwasser 1:1 verdünnt und lichtgeschützt unter mehrmaligem Schütteln 24h im Kühlschrank aufbewahrt.
Um die Ciliaten in Ihrer natürlichen Haltung "einzufrieren" ist es essentiell, dass sie
schlagartig mit der Fixierlösung in Kontakt kommen!
Dazu wurden je 5ml der Lösung in senkrecht stehende schmale Probenröhrchen aus Kunststoff gegeben.
Das hört sich trivial an, ist aber wichtig für den Erfolg.
Warum?
In breiteren Gefäßen vermischt sich der später eingebrachte Tropfen mit den Ciliaten nicht gut.
In flachen kleben die noch nicht durchfixierten Einzeller gerne am Boden des Behälters fest.
In dem hohen und etwas unter einem Zentimeter breiten Röhrchen passiert das nicht.
Die Teuthophrys habe ich dann einzeln mit je einer frischen billigen Einwegpipette aus Weichplastik aus der Kultur entnommen.
Die einzelnen Exemplare wurden mit ca 0.1ml (=ca 2Tropfen) Wasser aufpipettiert.
Dann wird die Pipette mittig und senkrecht über das Röhrchen gehalten und
zügig, d.h. mit etwas Schwung entleert.
Durch die schmale Form des Röhrchen verwierbelt der Tropfen mit dem Ciliat und Probe und Fixierlösung vermischen sich sehr schnell.
Der Ciliat wird so
blitzartig fixiert und sinkt dann
langsam zu Boden.
Im unteren Teil ist die Lösung aufgrund der höheren Dichte des Glutaraldehyds auch noch stärker konzentriert. Zusammen mit dem langsamen Herabsinken, werden die Eiweiße der zu fixierenden Einzeller zumindest aussen so weit denaturiert, dass ein Verkleben mit dem Boden oder anderen bereits fixierten
Exemplaren vermieden wird. Ich lasse das Röhrchen dann noch eine kurze Weile stehen um sicherzugehen, dass die Fixierung so weit abgeschlossen ist.
Vollständig durchfixierte Ciliaten sind dann recht robust und vertragen sowohl umpipettieren als auch das "stapeln" einer größeren Anzahl am Boden eines Eppendorf Behälters recht gut.
Im Fall der Teuthophrys wurden die fixierten Ciliaten dann mit der Post verschickt.
Um eine Überfixierung zu vermeiden habe ich die Lösung in den Eppies dann noch weiter mit Fundortwasser verdünnt und dafür gesorgt, dass sich so wenig Luft wie möglich darin befindet.
Im Fall der Teuthophrys waren die Proben dann, der deutschen Post sei dank, über 2 Wochen unterwegs, bis sie Renés Labor erreichten.
Dort ging es dann mehr oder weniger wie in dem oben verlinkten Protokoll weiter.
Also Osmiumtetroxyd (hochgiftig!!! Nichts für's traute Heim, und muss unter einem geeigneten Abzug und mit Schutzausrüstung gehandelt werden!)
und dann über Akloholreihe entwässern und critical point trocknen usw....(siehe Protokoll)
LG Holger
vielleicht habe ich ja Glück.