Die Doppelfärbung mit den Fluorochromen Ho432 und Acridinorange basierte bisher auf der Hypothese, dass die mit Acridinorange grün bis rot gefärbten Organellen saure Organellen darstellen. Diese Hypothese wird auch gestützt durch eine einfache Analysen der kortikalen Granula von Spirostomum sp. mit Hilfe der klassischen Färbung mit Neutralrot.
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Experiment
Neutralrot ist ein Indikatorfarbstoff, der gelegentlich in der Lichtmikroskopie eingesetzt wird, um einen sauren pH in Zellkompartimenten darzustellen. Hier wurde der Farbstoff in einer Endkonzentration von 0,005% (1:20.000) verwendet. Für Abb. 1 wurde der Farbstoff an dem Spirostomum Stamm 0016 meiner Kulturen eingesetzt, um nachzuweisen, dass die kortikale Granula, welche auch von Foissner et al. (1992) als bestimmungsrelevant beschrieben ist, von sauren Vesikeln gebildet wird. Es ist noch unsicher, ob diese Vesikel mit den in der Literatur diskutierten Mucocysten von Spirostomum übereinstimmen, vieles spricht jedoch dafür. So auch der Befund, dass die kortikale Granula nach der Färbung mit Neutralrot große Lücken aufweist. Dies könnte ein Indiz dafür sein, dass die Mucocysten nach der Färbung zum Teil in die Umgebung als Abwehrreiz entladen wurden.
Wie viele andere "Vitalfarbstoffe" der klassischen Lichtmikroskopie auch, wird auch Neutralrot von Ciliaten offenbar nicht gut vertragen. Zumindest nicht in den hohen Dosen der Lichtmikroskopie. Intensives Licht führte rasch zum Versterben der Individuen unter dem Mikroskop. Es ist bekannt, dass Neutralrot auch gewisse Fluoreszenz-Eigenschaften besitzt. In wässrigem Medium wird angenommen, dass dieses Medium als "Quencher" wirkt, was bedeutet, dass die Fluoreszenz unterdrückt ist. Allerdings scheint meine Beobachtung eher in die Richtung zu weisen, dass Neutralrot dort keine Fluoreszenz zeigt, wo es lichtmikroskopisch gut färbt. Hingegen zeigt die übrige Zelle dort, wo man lichtmikroskopisch keine Färbung findet, eine deutliche rote Fluoreszenz (keine Autofluoreszenz). So ist anzunehmen, dass bei der relativ hohen Konzentration des Farbstoffs in der ganzen Zelle, gefärbt oder nicht, dieser im sauren Milieu sein eigener "Quencher" ist. Mit anderen Worten: In gefärbten Organellen findet nicht nur ein Farbumschlag, sondern auch eine Fluoreszenzlöschung in den sauren Organellen statt, die vermutlich von der Konzentration des Farbstoffs abhängt (Ionenfalle). Der Energieübertrag des Farbstoffs auf die Zelle führt bei heller mikroskopischer Beleuchtung zum raschen Zelltod. Ein weiterer Beleg dafür, dass der Begriff "Vitalfarbstoff" den nicht eingearbeiteten Mikroskopiker in die Irre führt. Sehr vital erscheinen meine Probanden nicht mehr. Im Gegensatz zu "Vitalfarbstoffen" werden Fluorochrome in Verdünnungen angewandt, die mindestens um den Faktor 100 geringer sind. Diese geringere Dosis lässt Fluorochrome weniger schädlich auf die einzelligen Wimpertiere wirken.
Abb. 1: Spirostomum sp., Färbung mit Neutralrot: Die kortikale Granula wird von Neutralrot karminrot bis dunkelrot gefärbt. Der pH-Wert der Granula liegt damit unterhalb von pH 6,8 im sauren Bereich. Offenbar durch die Färbung bedingt entstanden Lücken. So fehlen große Teile der normalerweise lichtmikroskopisch beobachtbaren Granula.
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Abb. 2: Der unsichtbare Tod - Fluoreszenz von Neutralrot in der Zelle. Eine erhöhte Fluoreszenz findet nicht in den gefärbten Teilen der Zelle statt, sondern in den lichtmikroskopisch ungefärbt erscheinenden Teilen der Zelle. Hier gut zu erkennen an einem Exemplar von Spirostomum, welches unter dem Einfluss des Lichts rasch verstarb. Der Grund dürfte in dem Energieübertrag des visuell unsichtbaren, in der Fluoreszenz jedoch sehr gut sichtbaren Fluoreszenzeigenschaften des Farbstoffs in der hohen Dosis begründet sein, der zur Zelllyse führte.
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Abb. 3: Die kortikale Granula (Gr) von Spirostomum Arten wird auch von Acridinorange in Farben von Grün über Gelb bis Rot gefärbt, was den Ionenfallen-Mechanismus dieser sauren Organellen auch in der Fluoreszenzfärbung bestätigt. Hier am Beispiel von Sp. ambiguum.
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