Schuppenpräpartion bei Bauchhärlingen am Beispiel Lepidochaetus zelinkai

[Michael]

Hallo in die Runde,

bei Bauchhärlingen erfolgt die Arteinteilung traditionell über die Form der Schuppen. Daher ist die Artbestimmung oft nur möglich, wenn man die Schuppenform der Tiere genau beurteilen kann. Leider sind die Schuppen der Gastrotrichen oft nur schwer zu sehen. Selbst mit DIK - obwohl hier die schwache Doppelbrechung der Schuppen den Kontrast noch zusätzlich verstärkt - ist bei vielen Arten eine Lebendbeobachtung zur Artdiagnose nicht ausreichend. Deshalb möchte ich hier eine Möglichkeit zur Präparation der Schuppen und damit zur (meist) sicheren Artdiagnose vorstellen.
Als Beispiel habe ich Lepidochaetus zelinkai (ehemals Chaetonotus zelinkai) gewählt. Durch das markante Erscheinungsbild dieses Gastrotrichen ist eine Schuppenanalyse zur Artbestimmung eigentlich nicht nötig, aber einige Schuppendetails werden in der Literatur kontrovers diskutiert, so dass ich mir mal selbst ein Bild machen wollte.

L. zelinkai ist ein mittelgroßer Gastrotrich mit einem markanten Stachelkleid:


Bild 1: Lepidochaetus zelinkai: Übersicht

Selbst bei stärkerer Vergrößerung werden nicht alle Details der Beschuppung deutlich:


Bild 2: Lepidochaetus zelinkei: Schuppen des ventrales Zwischenfeldes

Um die Schuppen frei zu präparieren, muss das Tier mazeriert werden. Dazu legt man das Tier - am besten mit einem einfachen Vaseline-Kopressorium - mit dem Deckglas fest und zieht einen Tropen Eisessig unter das Deckglas. Den Eisessig haben ich vorab mit sehr wenig Eosin angefärbt - dadurch werden die Schuppen gleichzeitig bei der Mazeration gefärbt. Der Eisessig löst alle Weichteile des Tieres innerhalb weniger Minuten auf, während die Schuppen der Gastrotrichen säurebeständig sind und deshalb erhalten bleiben. Je nach Schuppengefüge verbleiben die Schuppen als zusammen hängende Hülle erhalten oder lösen sich voneinander. Bei L. zelinkai sind die Schuppen anscheinend nicht miteinander verzahnt, so dass die Schuppen sich verteilen:







Diese Art der Präparation ist recht einfach und erlaubt es, die Schuppenformen genau zu beurteilen. So fallen z.B. bei den obigen Bildern die Stege in der Schuppenfläche auf, die sich parallel zur Vorderkante erstrecken. In der Literatur werden diese "doppelten Ränder" der Schuppen meist als optisches Artefakt angesehen, das durch den zweifachen Schnitt der Fokusebene durch die gebogenen Schuppen erzeugt wird. Die obige Schuppenanalyse belegt eindeutig, dass diese auffälligen Stege wirklich existieren und eine Verdickung der Schuppen darstellen.

Es wäre natürlich schön, solche Präparate zu einem Dauerpräparat zu verarbeiten. Kennt jemand eine Methode, um ein wässriges Präparat ohne das Deckglas zu entfernen zu einem Dauerpräparat (z. B. in Euparal) zu überführen? Für Tipps wäre ich dankbar!

Viele Grüße

Michael

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PS: Dieser Beitrag wird parallel im Mikroskopie-Forum veröffentlicht

[Monsti]

Hallo Michael,

einen Tipp zur Präparation kann ich Dir leider nicht geben, ich gratuliere Dir aber zu dieser großartigen Dokumentation.

Lepidochaetus zelinkai gehört ja zu den besonders auffälligen Gastrotrichen, bei denen man das Glück hat, sie fotografisch gut einfangen zu können, weil sie oft recht ruhig an einem Standort verharren. Bei sehr vielen anderen, meist viel kleineren Bauchhärlingen habe ich aber das Problem, dass sie viel zu agil sind, um sie so zu erwischen, dass man ihre Schuppendetails ablichten kann.

Hast Du diesbezüglich (außer dem Blitz) gute Tipps?

Herzliche Grüße
Angie

[Michael]

Hallo Angie,

es freut mich, das mein Beitrag für Dich von Interesse war.

Die Schuppendetails von Gastrotrichen abzulichten, ist meistens ein großes Problem. Selbst bei der gezeigten Schuppenpräparation gelingt das nur bei den Arten mit größeren Schuppen:


Chaetonotus persetosus, ein recht kleiner Gastrotrich - aber mit großen Schuppen

Viele kleinere Arten haben winzige Schuppen im µm-Bereich. Da hilft dann oft auch eine Schuppenpräparation kaum weiter:


kleine Aspidiophorus-Art mit winzigen Schuppen

Oft muss man dann halt auf die Bestimmung bis auf Artniveau verzichten und sich mit Gattung oder Untergattung zufrieden geben.
Die Beobachtung von Gastrotrichen in temporären Präparaten ist oft sehr problematisch. In frischen Präparaten igeln sich die Tiere gerne unter Detritus-Flocken ein und sind gar nicht zu finden. Tauchen sie dann auf, rasen sie wie verrückt in Todesangst herum - kein Wunder: durch die Verdunstung des Wassers ändert sich der Salzgehalt der Probe kontinuierlich und das Deckglas senkt sich ab (das erinnert mich immer irgendwie an die Geschichte "Grube und Pendel" von Edgar Allen Poe). Erst wenn die Tiere nach einigen Stunden in einem Langzeit-Präparat sind, beruhigen sie sich und zeigen ihr natürliches Verhalten. Dann erkennt man, das Gastrotrichen normalerweise ruhig ihre Bahnen ziehen und in Ruhe z. B. das Deckglas abweiden (dann sind sie optimal beobachtbar). Um diese Beobachtungen zu ermöglichen, habe ich einen Beitrag über die Erstellung von Mikroaquarien eingestellt (viewtopic.php?f=45&t=721). Am Ende des Films, den ich dort zeige, sind auch einige Gastrotrichen live zu sehen. Ich glaube, die Ruhe bei diesen Beobachtungen spricht für sich.

Viele Grüße

Michael

[RalfF]

Hallo Michael,

auch ich kann Dir leider keine Tipps zu der von Dir erwünschten möglichen Präparationsmethodik geben - deshalb hatte ich bislang auch nichts geschrieben! Nun möchte ich Dich aber auch ermuntern, uns auch weiterhin an den interessanten Beobachtungen Deiner "Haustiere" teilhaben zu lassen! Deine Fotos mit "Schiefer Beleuchtung" sind ebenfalls klasse und lehrreich, ganz zu schweigen von der perfektionierten "Mikroaquarientechnik"!
Ich gehöre meist zu den stillen Genießern (auch im Mikro-Forum), weil ich denke, dass die erfahreneren User meist das Entscheidende bereits gesagt haben - ich weiß aber auch, dass ein Forum von der Teilnahme der User lebt. Daher auch diese Antwort und - vor allem, weil Dein Beitrag klasse ist!

Beste Grüße
Ralf

[Monsti]

Hallo Michael,

vielen Dank für die weiterführenden Infos (auch im anderen Thread zum Mikro-Aquarium). Nun werde ich mir Objektträger mit Vertiefung besorgen und Deine Tipps umzusetzen versuchen.

Deine schiefe Beleuchtung gefällt auch mir außerordentlich gut. Zwar arbeite ich ebenfalls mit schiefer Beleuchtung, doch verwende ich dafür schon seit mehreren Jahren den Phako-Kondensor. Möglicherweise steige ich aber wieder auf den Kreutz-Sichel um ...

Herzliche Grüße
Angie

[Michael]

Hallo Ralf und Angie

@Ralf:
Vielen Dank für Dein Lob! Wenn ich einen Beitrag einstelle, hoffe ich immer auf eine Diskussion, die es mir ermöglicht, mir selbst über die Details des Themas klar zu werden. Nur wenn man was erklären kann, hat man es auch verstanden! Deshalb sind mir Antworten von unerfahren Usern mindestens genauso willkommen wie die von erfahreneren. Ich würde mich freuen, wenn Du Dich nicht von Antworten und Fragen abschrecken lässt - damit hilfst Du auch mir!

@Angie:
Man kann die Vaseline-Abdichtung auch mit Präparaten ohne Hohlschliff vornehmen. Dann überleben die Organismen halt nur ein bis zwei Tage - lange genug, dass sich die "Anfangspanik" legt.

Mir war gar nicht klar, dass meine "schiefe Beleuchtung" soviel Lob verdient, zumal ich sie denkbar einfach realisiert habe. Ich habe das Verfahren mal in https://www.mikroskopie-forum.de/index. ... c=32851.19 (Antwort #19) mit Fotos gezeigt. Sowas lässt sich wohl mit jedem Mikroskop realisieren. Man muss nur etwas experimentieren, wo man die Blende am besten platziert und wie man ermöglicht, diese für jedes Objektiv optimal einzustellen.

Viele Grüße

Michael

[paramecium]

Hallo Michael,

das ist eine tolle Foto-Dokumentation.

Was die weitere Vorgehensweise zum Dauerpräparat angeht: Bei der Färbung von einzelnen Ciliaten hatte ich schon Erfolg, diese mit der Stereolupe auf dem Objektträger zu platzieren und zu präparieren (ohne Deckglas). Ich denke, das wäre eine Option. Da es hier nicht auf die Erhaltung des Individuums ankommt, ist die Art der Fixierung hier ja egal. Den Eisessig würde ich versuchen mit einer Mikropipette in kleinem Volumen hinzuzugeben. Dann am Rand des Tropfens vorsichtig mit einem Zellstoff abziehen oder einfach verdunsten lassen. Ich vermute die aufgelösten Zellbestandteile verteilen sich mit dem Tropfen flächig. Ich würde dann versuchen, das Präparat lufttrocknen zu lassen. Bei Bakterien fixiert man diese anschließend am Objektträger indem man die Unterseite des getrockneten(!) Objektträgers mit dem Präparat kurz durch eine Flamme zieht. Eventuell tut eine Heizplatte auch ihren Dienst. Dabei haften die Proteine dann am Glas. Dann vorsichtig einen kleinen Tropfen Alkohol, trocknen lassen und dann über Xylol das noch Xylol-feuchte Präparat in Kanadabalsam eindecken. Keine Ahnung ob das auch bei den Schuppen funktioniert.

Eosin wird dabei leider ausgewaschen. Und selbst wenn die Differenzierung gelingt, verblasst es später unter dem Einfluss von Licht. Von daher würde ich eventuell zu einem anderen Farbstoff tendieren.

Du schreibst, man wüsste noch nicht genau, aus welchen Materialien die Schuppen bestehen. Ich habe eben mal nachgesehen, was von Eosin eigentlich gefärbt wird. Der Farbstoff färbt azidophile Strukturen. Romeis spricht auch von "eosinophil". Es werden wohl in der Hauptsache Proteine und andere basische Materialien gefärbt. Auf die Schnelle fand ich noch eine interessante Arbeit, die den Farbstoff als Alternative für die Färbung von Proteinen in Gelen verwendet. Hier wird gewöhnlich Coomassie Blau R-250 zur Färbung genutzt. Eventuell wäre CB R-250 eine Alternative zu dem leider nicht lichtechten Eosin um Dauerpräparate herzustellen. Und vielleicht, ich spekuliere hier, ein Schritt zu der Erkenntnis, ob es Proteine sind, oder nicht.

Aber Versuch macht kluch. Ich würde so beginnen und dann sehen was heraus kommt. Wobei mich das noch auf eine Idee bringt...

Gruß

Thilo

[Michael]

Hallo Thilo,
die Idee, ohne Deckglas zu präparieren ist gut - schließlich ist es ja egal, wie sich der Gastrotrich beim fixieren verkrümmt. Das werde ich mal ausprobieren!

Viele Grüße und Danke für die Idee,

Michael

[Pelagodileptus]

Hallo Michael,

ich kann mich den anderen nur anschließen, ich hätte es nicht besser machen können und so wie es Thilo geschrieben hat, ist auch meine Methode der Präparation. Hat den Vorteil, dass man die Bauchhärlinge unter Deckglas nicht erst quälen muss !

Danke für den tollen Beitrag,
Michael