Präparation empfindlicher Organismen mit Vaselinefüßchen

[wejo]

Jeder kennt das Problem wahrscheinlich:

Hohe Vergrößerungen am Mikroskop (≥40x des Objektivs) erfordern eine höhere Apertur und damit weitere Ausleuchtung der Pupille des mikroskopischen Objektivs. Für höhere mikroskopische Auflösung muss man zu einem Trick greifen: Spezielle Immersionsobjektive und eine Immersionsflüssigkeit zwischen Objektiv und Deckglas gestatten es, dass das Licht einen höheren Austrittswinkel nimmt, bevor es durch Totalreflexion vernichtet wird. Dadurch wird das Objektiv weiter ausgeleuchtet und man erhält eine höhere Auflösung im Bild.

Leider hat die Immersion mit Öl-, Glyzerin- und Wasserimmersionen einen gravierenden Nachteil: Eine seitliche Bewegung des mikroskopischen Präparats unter dem Mikroskop wird durch die Viskosität (Zähigkeit) der Flüssigkeit zwischen Objektiv und Deckglas versuchen, das Deckglas ebenfalls seitlich mit zu reißen. Dies kann im schlimmsten Fall zum Zerreissen eines empfindlichen Organismus unter dem Deckglas führen, welchen man eingeklemmt hat, um ihm zu fixieren. Dieser Nachteil ist gut bekannt und viele Mikroskopiker scheuen oft die Immersion aus genau diesem Grund. Bestimmte Immersionsöle sind aufgrund ihrer hohen Viskosität hierfür "berüchtigt". Eine Variante besteht darin bestimmte, besonders dünnflüssige Immersionsöle oder Wasser zu verwenden. Aber auch hier sind Grenzen gesetzt, da jede Flüssigkeit in solch dünnen Filmen, wie sie Mikroskopiker gerne haben, über bestimmte Scherkräfte verfügt, die ein Deckglas mitzunehmen vermag - um Organismen zu zerstören, die unter dem Deckglas geklemmt ist.

Hier kommt nun die Vaseline ins Spiel.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten mit Vaseline ein Deckglas zu fixieren oder gar abzudichten. Eine Idee hierzu habe ich auf der Planktonwoche in Bodman mitgenommen. Der ungenannte Ideengeber sei an dieser Stelle gewürdigt. Ich möchte hier nur diese spezielle Technik beschreiben: Vaselinefüßchen mit einer Kanüle aufbringen. Die Vaselinefüßchen stabilisieren das Deckglas und verhindern, dass es sich seitlich bewegt. Dennoch erlauben sie, dass beim Verdunsten ein anderer gewünschter Effekt eintritt: Das Deckglas sinkt mit dem Verdunsten des Wassers der Kulturflüssigkeit herab und klemmt auch agile Organismen irgendwann ein, so dass man sie komfortabel fotografieren kann. Jedoch bewegt sich das Deckglas praktisch nicht zur Seite.

Benötigte Utensilien

1. Vaseline aus dem Drogeriemarkt
2. Eine Kanüle 2 ml mit passender Nadel und Schutzkappe (entbehrt der Hausarzt sicherlich gerne für den guten Zweck)
3. Objektträger und Deckglas
4. Das zu präparierende Objekt im Kultur- oder Fundortmedium

Befüllen der Kanüle
Die Öffnung der Kanüle (ohne Nadel) setzt man in die Vaseline und zieht die Spritze langsam auf, so dass sie sich mit Vaseline füllt. Vaseline ist sehr zäh, so dass man etwas Geduld benötigt, um keine Luftblasen zu ziehen. Nun setzt man die Nadel auf die Kanüle und sie ist einsatzbereit. Nach jeder Präparation sollte der Stempel der Kanüle leicht zurückgezogen werden und die Schutzkappe vor der Nadel (im Bild oberhalb der Kanüle) wieder aufgesetzt werden um die Nadel zu schützen und Verletzung zu vermeiden. Vaseline ist zäh: Durch kurze Wirkung eines Zugs auf den Stempel der Kanüle vermeidet man auch, dass unnötig viel Vaseline weiterhin über die Nadel austritt.

Präparation
Man präpariert nun wie gehabt die Kulturflüssigkeit der zu untersuchenden Organismen und tropft diese in die Mitte des Objektträgers (für die Fluoreszenz: Fluorochrom und Kulturmedium werden hier aufeinander getropft). Nun setzt man nach Augenmaß vier kleine Vaselinetropfen um den Tropfen herum mit leichtem Druck auf die Kanüle so auf den Objektträger, dass zwei kleine Vaselinetropfen in etwa den Ecken des aufgelegten Deckglases entsprechen. Man sollte mit leichtem Druck nur ganz wenig Vaseline auftropfen (siehe Bild). Die Abbildungen zeigen übrigens auch, dass ich gerne eine leicht zu reinigende Glasauflage unter dem Mikroskop nutze. Diese kann man im einschlägigen Möbelmarkt für kleines Geld erwerben.

Nun wird vorsichtig das Deckglas aufgesetzt, wobei die Vaselinetröpfchen von den Deckglasecken erfasst werden sollen.

Das Präparat ist nun fertig!

"Professionelle" Variante
Um die Vaselinefüßchen sicher anzusetzen, empfiehlt es sich eine Schablone anzufertigen mit den Maßen de Objektträgers und der verwendeten Deckgläser. Deckgläser gibt es meist in zwei verschiedenen Größen: 18x18 mm und 22x22 mm. Eine Schablone ist schnell am Computer entworfen und ausgedruckt. Hier zeige ich eine Variante, die ich immer gerne auf mikroskopischen Treffen kostenlos als Hilfsmittel verteile. Meine Visitenkarte enthält das Auflagemaß für Objektträger und die beiden gängigen Größen für Deckgläser, um die Füßchen sozusagen "blind" aufzusetzen, bevor das Deckglas aufgesetzt wird.

Die Kanüle, die hier abgebildet ist und die ich seit einiger Zeit verwende, ist immer noch dieselbe, die ich in Bodman von dem Kollegen geschenkt bekam. Mikroskopisch kleine, verwendete Volumina von Flüssigkeiten machen es möglich, dass die bisher einmalige Befüllung der Kanüle vor drei Jahren noch immer ausreicht. Die Idee ist einfach genial und soll hier geteilt werden.

[Michael]

Hallo Thilo,
schön, dass Du die "Vaseline"-Methode hier vorstellst die eine der befriedigendsten Methoden zum genauen Beobachten bei geringer Schichtdicke darstellt. Ich verwende Sie seit Jahren, wenn eine genauere Untersuchung als in meinen Vaseline-Mikroaquarien nötig ist. Es gibt einige Variationen zur Technik, die mir recht praktisch erschienen:

Zum Auftragen der Vaseline-Füßchen gehe ich etwas anders vor. Ich schmiere etwas Vaseline dünn auf meinen Handballen und streiche einfach mit den Ecken des Deckglases eine minimale Menge vom Handballen ab. Der Vorteil ist, dass man die Menge sehr gut steuern kann und man - da die Vaseline am DG sitzt - beim Positionieren des DG keine Probleme hat. Durch Andrücken des DG an den Ecken kann man recht leicht die gewünschte Ausgangs-Schichtdicke einstellen.
Wenn es mir mehr um die Beobachtungszeit geht, das Präparat aber zu Färbezwecken weiterhin zugänglich sein soll, streiche ich an den zwei gegenüber liegenden DG-Seiten einen vollständigen dünnen Vaselinesteg von der Hand ab. Durch die teilweise Abdichtung des Präparates wird die Verdunstung stark verringert und die Beobachtungszeit auf einige Stunden erhöht. Die Schichtdicke muss nun durch Andrücken eingestellt werden und verändert sich während der Beobachtungszeit nur minimal. Durch die gegenüber liegenden freien DG-Seiten kann man problemlos Farbstoffe durchs Präparat ziehen.
Möchte man die Verdunstung fast vollständig ausschließen, kann man 3 1/2 Seiten des DG mit einem dünnen Vaselinesteg versehen, also an einer Seite eine kleine Lücke lassen, durch die beim Festrücken bzw. Einstellen der Schichtdicke die Luft entweichen kann. Ein solches Präparat hat den Vorteil, dass man auch am DG-Rand problemlos Immersions-Objektive verwenden kann, da das Öl nicht unter das DG ziehen kann. Die Beobachtungszeit wird maximal verlängert (auf einige Tage) und man kann von Hand wegen des Widerstands des Vaselinerandes die Schichtdicke sehr fein während der Beobachtung verringern (Ich drücke den DG-Rand einfach mit einem Holzstäbchen während der Beobachtung weiter an).

Ich denke, es gibt viele Möglichkeiten, ein Vaseline-Präparat zu erstellen und jeder muss für sich selbst seine Lieblingsmethode finden. Die Vaselinetechnik erweitert aber auf jeden Fall die "normale" Präparationsmethode ungemein und gibt einem eine Freiheit, die den Aufwand allemal wert ist.

Viele Grüße

Michael