Vorticella convallaria - Darstellung des Micronucleus

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paramecium
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Vorticella convallaria - Darstellung des Micronucleus

#1 Beitrag von paramecium » 21. Dezember 2016, 20:30

Hallo liebe Foristi,

ich wünsche ich den Teilnehmern ein frohes Weihnachtsfest und Angie gute Besserung!

Aus einer seit 4 Wochen stehenden Probe eines kleinen Moor entnommen habe ich einige Vorticella, die noch der genaueren Bestimmung der Art harren(*). Da das Moor angesichts der weiter anhaltenden Trockenperiode heuer schon zum zweiten Mal trocken liegt, bin ich wohl der einzige, der weihnachtlichen Regen zur weiteren Probenentnahme sehnsüchtig erwartet.

Häufig übersehen bei den Vorticella ist der unscheinbare Micronucleus, welcher mit einem geringeren Kontrast im Hellfeld erscheint und mit den Nahrungsvakuolen zu verwechseln ist. Selbst Foissner und Kahl erwähnen ihn nicht. Erst die Färbung offenbart den tatsächlichen Ort in der Zelle. Hier geschehen durch Doppelfärbung mit den Fluorochromen Hoechst 33342 und Acridinorange. Beobachtung erfolgte unter UV Anregung. Die Phagosome (=Nahrungsvakuolen) erscheinen hierbei kontrastreich rotrange (saurer pH) bis grün (höherer pH) gefärbt, während gefärbte DNA des Macronucleus (Ma) und Micronucleus (Mi) blau gefärbt erscheinen. Ebenfalls gut zu erkennen: Es handelt sich um einen Bakterienfresser. Dies zeigen die winzigen Klümpchen gefärbter Bakterien-DNA (Ba) in einigen Phagosomen. Der Unterschied zu den Phagosomen: Der Micronucleus erscheint homogen und heller gefärbt, während die zu verdauenden Bakterien (eventuell auch einige Parasiten innerhalb des Plasmas oder Aufsitzer entlang des Zellmunds liegend) als winzige, blaue Punkte erscheinen.

Die Fotomontage zeigt verschiedene Exemplare der Vorticella aus der gleichen Probe, welche an Detritus haften.

Falls jemand einen Tipp zur genaueren Artbestimmung hat, wäre ich dankbar für jedweden Hinweis worauf zu achten wäre.

Aktuell gehe ich davon aus, dass die abgebildeten Exemplare einer Art zugehörig sind. Die gemessene Körperlänge verschiedener Exemplare liegt um 55-70 µm. Der untere Basalteil variiert ebenfalls und zeigt eine kaum bis deutlich abgeschnürte Furche bei einer Länge des Basalsegments um 14 µm entlang der Körperachse (vgl. Abb. oben links/rechts, unten links). Die Länge des Stiels beträgt um 130 µm, gelegentlich erscheint er kürzer (unten rechts). Bei "erschrockenen" Exemplaren wird der Stiel nicht vollständig eingerollt, sondern oft nur mit 1-2 Windungen etwa auf halber Länge, darüber und darunter ein Stück gerade (vgl. Abb. unten links). Die Körperform variiert stark, wie das "halb verhungerte" Exemplar oben links zeigt. Jedoch ist die feine Querstreifung mit dem 40x/0,75 Objektiv meist gut erkennbar. Die Querstreifung variiert wie auch bei Kahl für einige Arten beschrieben in der Deutlichkeit über die Zelloberfläche. Der auffällige Macronucleus erscheint gelegentlich "J"-förmig, meist jedoch eher verwunden wie ein verdrehtes "C" (vgl. Abb. mitte links und rechts). Es gibt nach meiner Beobachtung nur eine pulsierende Vakuole im oberen Drittel des Korpus (vgl. Abb. oben rechts). Das Körperverhältnis liegt zwischen 3:1 und 2:1 Länge zu Breite des Konus. Moosformen der Vorticella Arten sind nicht auszuschließen, da die Probe mit sehr niedrigem Wasserstand ca. eine Woche nach erstem Regenfall unter Fallaub entnommen wurde. Aktuell wächst sie auf dem verrottenden Falllaub in der Probe. Eine Versilberung steht noch aus. Von der Größe her kämen einige Arten wie V. gracilis, V. extensa und V. similis in Betracht.

Abbildungen mit Plan-Neofluar 40x/0.75 bzw. N-Achroplan 20x/0.45 (Übersichtsfoto, unten rechts).

Viele Grüße

Thilo

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Zuletzt geändert von paramecium am 30. Dezember 2016, 10:00, insgesamt 1-mal geändert.
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Re: Vorticella spec. - Darstellung des Micronucleus

#2 Beitrag von ImperatorRex » 25. Dezember 2016, 21:00

Hallo Thilo,
vielen Dank für diesen sehr interessanten Artikel. Ich lese Deine Artikel immer sehr interessiert mit, habe aber bislang noch nicht selber mit Fluorochromen gefärbt.
Würde eine Färbung nur mit Acridinorange auch funktionieren? Was ist der Vorteil von einer Doppelfärbung zusammen mit Hoechst 33342?
Es hat den Anschein, dass der Mikronukleus bei der Bestimmung von V. kaum eine Relevanz hat und deshalb etwas stiefmütterlich behandelt wird.

viele Grüße
Jochen

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Re: Vorticella spec. - Darstellung des Micronucleus

#3 Beitrag von paramecium » 28. Dezember 2016, 20:50

Hallo Jochen,

vielen Dank für Deine Antwort.

Acridinorange ist sicherlich viel günstiger in Mengen zu haben, die man kaum zu Lebzeiten aufbrauchen kann (z.B. bei Omikron). Die Färbung mit Acridinorange ist ebenso einfach zu bewerkstelligen und auch zur Färbung des Zellkerns geeignet, z.B. empfohlen in älteren Artikeln des Mikroskosmos. Übrigens ist Blauanregung (470 nm) günstiger, als UV Anregung.

Acridinorange ist jedoch nicht so zuverlässig bei der Differenzierung des Zellkerns von Protisten (gilt generell auch für andere Zelltypen auch höherer Organismen). So erscheinen auch andere Organellen gefärbt, meist Phagosome und kleinere, saure Vesikel. Oft erscheint der Kern bei Protisten sogar ungefärbt. Allerdings interessiert mich seit einiger Zeit insbesondere "diese andere Färbung" des Acridinorange. Zur guten Darstellung von (Zellkern-) DNA ist Hoechst 33342 nach meiner Erfahrung besser geeignet. Alternativen sind Hoechst 33258, Hoechst 34580 oder DAPI.

Viele Grüße

Thilo

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Re: Vorticella spec. - Darstellung des Micronucleus

#4 Beitrag von paramecium » 29. Dezember 2016, 14:01

Nachtrag:

Jetzt hat es mich doch selbst interessiert und ich habe meine Aufnahmen durchgesehen, ob ich von einem Exemplar nicht doch beide Varianten abgelichtet habe: UV und Blauanregung. Hier liefere ich somit noch den A/B Vergleich der Doppelfärbung unter UV (385 nm) bzw. Blauanregung (470 nm) für die Vorticella Probe. Unter Blauanregung fluoresziert lediglich das Acridinorange (AO), während in UV Anregung vorwiegend das Hoechst fluoresziert, sowie Acridinorange vorwiegend in roter Farbe angeregt erscheint.

Wie man im Vergleich der Aufnahmen von Vorticella erkennt, erscheint der Micronucleus (Mi) mit Acridinorange nicht so überzeugend gefärbt erscheint (Kreis). Ob das bei diesem Exemplar an Plasmabewegung zwischen den Aufnahmen liegt, vermag ich nicht zu sagen. Zwischen beiden Aufnahmen vergingen nur wenige Sekunden und es ist eher unwahrscheinlich, dass der Mi schlagartig verrutschte. Ich tippe daher darauf, dass der Mi ungefärbt blieb.

Ein ähnliches Bild erhält man entlang der innerhalb der Mundöffnung vermutlich gefärbten Bakterien DNA (Ba). Auch hier liefert die AO Färbung nur Teile der gefärbten DNA gegenüber der Färbung mit dem Hoechst Farbstoff. Hingegen färbt Acridinorange auch andere Organellen, wie Zellplasma und Phagosome (Ph) in diesem Fall.

Ähnliches habe ich schon oft beobachtet, dass nämlich Vorticella mit Acridinorange gefärbt in allen Farben leuchtet, während der Zellkern (Macronucleus) während der Beobachtung rasch ausbleicht ("Fading"), so dass man den Zellkern mitunter nicht mehr findet, sondern lediglich Plasma und Phagosome gefärbt erscheinen. Ein weiterer Grund, warum die Färbung so unterschiedlich ausfällt mag daran liegen, dass das Hoechst bis-Benzimid sich vorwiegend außen an A-T reiche Nukleinsäure-Gruppen anlagert, während Acridinorange eher interkaliert, d.h. sich (wahllos) zwischen die DNA Doppelhelix drängt.

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Re: Vorticella convallaria - Darstellung des Micronucleus

#5 Beitrag von paramecium » 30. Dezember 2016, 10:04

Nachtrag: Ich habe den Titel des Eingangsbeitrags geändert, da ich nach Sichtung aller Detailaufnahmen nun sicher bin, dass es sich um Vorticella convallaria handelt.

Unsicher bin ich noch bezüglich der Bestimmung freier Schwärmer in derselben Probe, die jedoch größer erscheinen und zudem eine schräge aborale Wimpernzone besitzen. Dazu werde ich eventuell später mehr in einen neuen Thread schreiben.

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Re: Vorticella convallaria - Darstellung des Micronucleus

#6 Beitrag von ImperatorRex » 30. Dezember 2016, 11:46

Hallo Thilo,
besten Dank! Ein ergibiges Thema ... bleibe da am Ball! Danke auch für den Hinweis auf die Acridinorange Färbung in dem Mikrokosmos, danach werde ich gleich mal schauen.

viele Grüße
Jochen

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Re: Vorticella convallaria - Darstellung des Micronucleus

#7 Beitrag von paramecium » 30. Dezember 2016, 20:43

Hallo Jochen,

ein etwas aktuellerer Literaturhinweis von meiner Seite:

Bauer, T., Interpretation der Acridinorange-Färbung von Ciliaten (Ciliophora) des Süßwassers und des Bodens, Mikroskopie, Nr. 1, Mikroskopie, Dustri-Verlag Dr. Karl Feistle, 2015

https://www.researchgate.net/publicatio ... des_Bodens

Wenn Du interessiert bist, sende ich Dir gerne das Manuskript. Anfrage bitte per PN. Der Autor bin ich.

Gruß

Thilo

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Re: Vorticella convallaria - Darstellung des Micronucleus

#8 Beitrag von ImperatorRex » 1. Januar 2017, 11:49

Nochmals vielen Dank Thilo. Ich habe mir die pdf Datei des Artikels von der Internetseite heruntergeladen. Sehr hilfreich sind die konkreten Hinweise zur Herstellung der AO Gebrauchslösung. Bei meinen ersten Versuchen im letzten Jahr sind alle Paramecien schnell der Phototoxizität erlegen...

viele Grüße
Jochen

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Re: Vorticella convallaria - Darstellung des Micronucleus

#9 Beitrag von paramecium » 7. Januar 2017, 21:41

Hallo Jochen,

es freut mich, dass der Artikel weiter helfen kann. Die Phototoxizität ist bei hoher Dosierung der Fluorochrome in der Tat das größte Problem. Auch ich habe genau diesen Anfängerfehler gemacht.

Die im Artikel angegebene Dosierung des Acridinorange funktioniert am besten und kann auch als Richtlinie für sehr viele Fluorochrome gelten, etwa die beiden Rhodamine Rhodamin B oder Rhodamin 6G. Bei den hohen Lichtmengen gehen die Ciliaten meist jedoch am Licht zugrunde. Das lässt sich nicht ganz verhindern, weder in Fluoreszenz, noch im Hellfeld. LED Beleuchtungen vermeiden zwar die Erwärmung der Präparate, aber man sollte die enorme Lichtmenge eines Hellfeldkondensors in Verbindung mit einer leistungsstarken LED nicht unterschätzen.

Mit der angegebenen Dosierung konnte ich auch über eine halbe Stunde ohne Unterbrechung und mehr Vorgänge in Paramecium studieren, ohne dass sie verstarben. Gelegentlich nutze ich die "Lichtfixierung" jedoch gezielt bei kleineren Ciliaten, welche meist nicht so robust sind.

Viele Grüße

Thilo

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