Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange

[paramecium]

Hallo Tümpler,

hier möchte ich eine schon mehrfach von mir gezeigte Fluoreszenzfärbung vorstellen, die ich in den letzten vier Jahren sozusagen zur Serienreife entwickelt habe. Ich verwende diese Doppelfärbung mit den Fluorochromen Hoechst 33342 und Acridinorange (AO-Zinkchlorid) seit einigen Jahren mit Erfolg bei der Bestimmung und weiteren Untersuchung der Ciliaten. Die Methode ist kürzlich in der Zeitschrift Mikroskopie, Ausgabe 1/2019 veröffentlicht worden, worüber ich mich sehr freue. Mein Dank gilt hier vor allem C. Fehse vom Institut für Nutzpflanzenwissenschaften und Ressourcenschutz (INRES) der Universität Bonn, dem Herausgeber Jörg Piper, sowie unserem Mitglied RalfF für die Korrekturen des Originalartikels.

Zusammenfassung
Hoechst 33342 (Ho342) färbt DNA bei UV Anregung spezifisch in blauer Farbe. Acridinorange (AO) färbt ebenfalls DNA. AO ist für die DNA Färbung der Protisten jedoch kein zuverlässiger DNA-Farbstoff. Eine andere Eigenschaft macht Acridinorange jedoch wiederum sehr interessant in dieser Kombination, da es sich in sauren Organellen akkumuliert. So werden Lysosome, Acidosome (Paramecium) und Phagosome (Nahrungsvakuolen) in grünen, gelben oder roten Farben gefärbt. Die Farbe ist abhängig von der Konzentration und auch abhängig vom (sauren) pH-Wert. Acridinorange fluoresziert in seiner festen Form rot. Diese Farbe entsteht bei hoher Konzentration des protonisierten Acridinorange ebenfalls, da sich die protonisierten Farbstoffmoleküle in sauren Organellen (Ionenfalle) konzentrieren und bei hoher Konzentration aneinander lagern (Stapelbildung).
Originalartikel

Bauer, T. Fluoreszenz-Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange zur Bestimmung der Arten von Ciliaten (Phylum: Ciliophora), Mikroskopie 1/2019, S. 2-19.

[Pelagodileptus]

Hallo Thilo,

vielen Dank für die Ausführliche Darstellung der Doppelfärbung bei Ciliaten. Ich Färbe zwar auch, allerdings meist nur mit Acridinorange-Zinkchlorid, aber nicht mit einer durchgängigen Konsequenz, so wie Du es seit Jahren praktizierst. Und der Fluorochrome von Höchst (Ho342) kommt mir mit seiner Blaufärbung der Zellkerne bei der Bestimmung sehr entgegen...

Danke nochmals für die kurze aber sehr Ausführliche Beschreibung,

Michael

[paramecium]

Hallo Michael,

die Färbung mit Acridinorange (AO-Zinkchlorid) ist eine spannende Sache. Ich hatte mir dieses Fluorochrom einst für den Anfang gekauft, weil es wirklich preiswert ist (meine Bezugsquelle: www.omikron-online.de). Ich kam darauf, als ich einen Artikel zur Kernfärbung von Ciliaten des Regenwurms im Mikroskosmos las. Die ersten Präparate habe ich hoffnungslos überfärbt. Das ergab aber genial gefärbte Paramecien in schrillen grün-roten Farben. Eine meiner ersten Aufnahmen finde ich heute in einem PDF der Hamburger Mikroskopiker wieder (man hat mich zwar weder gefragt, noch als Urheber benannt, aber es ehrt mich).

Die erhoffte Kernfärbung leistet der Farbstoff allzu oft jedoch nicht. Intakte, gesunde Zellen schaffen es leider einige Fluorochrome rasch wieder herauszupumpen (einige Autoren benennen diesen Effekt "Efflux Pump"). Selbst wenn der Kern gefärbt erscheint, beobachtet man bei den Ciliaten, dass er im Fluoreszenzlicht meist binnen Sekunden ausbleicht. Daher werden solche Fluorochrome in der Zytologie auch zur Detektion absterbender Zellen verwendet (=Apoptose). Das ist eines der Probleme, die es zu lösen galt.

Ich denke übrigens, dass auch das reine Acridinorange vergleichbare Ergebnisse produziert. Habe es aber nie probiert. Reines Acridinorange (freie Base) ist ein Vielfaches teurer, als das billige Doppelsalz, das man bei Omikron für knapp 6 EUR kaufen kann.

Viele Grüße

Thilo

[paramecium]

Die Arbeit ist nun auch frei verfügbar:
Bauer, T. Fluoreszenz-Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange zur Bestimmung der Arten von Ciliaten (Phylum: Ciliophora), Mikroskopie 1/2019, S. 2-19.

[ImperatorRex]

Vielen Dank Thilo für Deinen faszinierenden Artikel.
viele Grüße
Jochen