Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange

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paramecium
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Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange

#1 Beitrag von paramecium » 19. April 2019, 08:32

Hallo Tümpler,

hier möchte ich eine schon mehrfach von mir gezeigte Fluoreszenzfärbung vorstellen, die ich in den letzten vier Jahren sozusagen zur Serienreife entwickelt habe. Ich verwende diese Doppelfärbung mit den Fluorochromen Hoechst 33342 und Acridinorange (AO-Zinkchlorid) seit einigen Jahren mit Erfolg bei der Bestimmung und weiteren Untersuchung der Ciliaten. Die Methode ist kürzlich in der Zeitschrift Mikroskopie, Ausgabe 1/2019 veröffentlicht worden, worüber ich mich sehr freue. Mein Dank gilt hier vor allem C. Fehse vom Institut für Nutzpflanzenwissenschaften und Ressourcenschutz (INRES) der Universität Bonn, dem Herausgeber Jörg Piper, sowie unserem Mitglied RalfF für die Korrekturen des Originalartikels.

Zusammenfassung
Hoechst 33342 (Ho342) färbt DNA bei UV Anregung spezifisch in blauer Farbe. Acridinorange (AO) färbt ebenfalls DNA. AO ist für die DNA Färbung der Protisten jedoch kein zuverlässiger DNA-Farbstoff. Eine andere Eigenschaft macht Acridinorange jedoch wiederum sehr interessant in dieser Kombination, da es sich in sauren Organellen akkumuliert. So werden Lysosome, Acidosome (Paramecium) und Phagosome (Nahrungsvakuolen) in grünen, gelben oder roten Farben gefärbt. Die Farbe ist abhängig von der Konzentration und auch abhängig vom (sauren) pH-Wert. Acridinorange fluoresziert in seiner festen Form rot. Diese Farbe entsteht bei hoher Konzentration des protonisierten Acridinorange ebenfalls, da sich die protonisierten Farbstoffmoleküle in sauren Organellen (Ionenfalle) konzentrieren und bei hoher Konzentration aneinander lagern (Stapelbildung).

Bild 1: Paramecium caudatum mit einem degenerierten Macronucleus nach Konjugation. Ma=Macronucleus, Mi=Micronucleus, Ph*=Phagosom, Ac=Acidosome. Zeiss Multi-Immersionobjektiv 40/0,9.
Bild

Bild 2: Detailaufnahmen des gebildeten Phagosoms Ph* in verschiedenen Schärfeebenen von unten (A) nach oben (E) aufgenommen mit dem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop. Details sind unten im Haupttext beschrieben. Zeiss Multi-Immersionobjektiv 40/0,9.
Bild

Beispiel: Paramecium caudatum
Die Färbung zeigt deutlich Macronuclei (Ma) und Micronucleus (Mi) in blauer Farbe. Das hier abgebildete Individuum trägt noch einen fragmentierten Macronucleus nach vorheriger Konjugation, der erst nach weiterer Teilung wieder zu einem einzigen Nucleus kondensiert. Ebenfalls gefärbt erscheint die DNA gefressener Organismen in den Phagosomen, z.B. Bakterien, die ebenfalls blau oder blaugrün gefärbt erscheinen. Am Ende der Mundhöhle sind saure Organellen zu erkennen, die ein sich bildendes Phagosom (Ph*) umschließen. Bei der Fokussierung über verschiedene Schärfeebenen hinweg erkennt man sehr schön die Kugelform, die sauren Organellen (Ac, Acidosome, Lysosome) sowie die Öffnung (Pfeil) der Ausstülpung hin zur Mundhöhle, da es sich noch nicht geschlossen und abgeschnürt hat. In den sauren Organellen konzentriert sich Acridinorange (Ionenfalle) und führt je nach Konzentration zu Färbungen von grün über gelb bis rot. Bei den kleinen Organellen an der Vakoule handelt sich hierbei um winzige Acidosome (Ac, erstmals beschrieben für Paramecium) bzw. Lysosome, welche Verdauungsenzyme zu dem sich bildenden Phagosom transportieren und dieses wie eine Hülle umschließen. Später wird das Phagosom abgeschnürt wobei das ganze Phagosom gefärbt erscheint. Letztlich wandert das Phagosom durch die Zelle, bis der verdaute Rest wieder ausgeschieden wird. Gelegentlich lassen sich die Veränderungen des pH-Werts in einer Farbdifferenzierung zwischen Gelb und Rot beobachten. Allerdings ist Acridinorange nicht zum Messen des pH-Werts geeignet.

Material & Methode
Benötigt wird ein Epi-Fluoreszenzmikroskop mit UV Anregung und geeignetem UV Filtersatz mit Anregungswellenlänge zwischen 360-390 nm. Der Filtersatz soll einen Langpassfilter für die Emission (sichtbares Spektrum ab 400-700 nm) besitzen. Bandpassfilter, die nur einen schmalen Wellenlängenbereich wiedergeben können, sind nicht geeignet diese Färbung mehrfarbig aufzuzeigen. Ferner benötigt sind einstellbare Mikropipetten (2-20µl, 20-200 µl), passende Einwegpipettenspitzen, Eppendorfhütchen 1 ml zum Mischen und Lagern der Lösungen, geeignete Objektträger und Deckgläser und eine feuchte Kammer. Eine Farbkamera ist erforderlich, um die Ergebnisse entsprechend zu dokumentieren. Ausführliche Hinweise zu Filtersätzen und zur Farbfotografie finden sich im Originalartikel. Ich verwende aktuell eine Canon EOS 77D über Fotoadapter 1.6x am Zeiss AxioLab.A1 FL-LED Fluoreszenzstativ.

Färbeprotokoll
Stammlösung 1: 10 mg Ho342 werden in 10 ml Aqua dest. gelöst.
Stammlösung 2: 10 mg AO-Zinkchlorid werden in 50 ml Aqua dest. gelöst.
Gebrauchslösung: 15 µl der Stammlösung 1 und 10 ml der Stammlösung 2 werden in 1 ml sterilem Leitungswasser verdünnt.

Stammlösung 1 wird am besten aliquotiert auf Eppendorfhütchen verteilt und eingefroren gelagert bis zum Ansatz einer neuen Gebrauchslösung. Stammlösung 2 kann bei Zimmertemperatur dunkel gelagert werden. Die Gebrauchslösung wird in einem Eppendorfhütchen dunkel gelagert (Zimmertemperatur) mindestens 6 Monate verwendbar. Sind die Ergebnisse nicht mehr reproduzierbar, sollte man einen Neuansatz erstellen. 1 ml der Gebrauchslösung ist sehr ergiebig und reicht beim Befolgen der folgenden Anweisung zur Färbung für etwa 200 einzelne Präparate.

Mikroskopisches Präparat
Sauberes und präzises Arbeiten sind das A+O wenn die Färbung gelingen soll. Objektträger und Deckgläser sind immer vorher zu reinigen und nur einmal zu verwenden. Objektträger die für die Fluoreszenz verwendet werden sind vorher zu testen. Nicht alle Marken sind geeignet. Ich verwende aktuell ausschließlich neue Objektträger der Marke BMS sowie Deckgläser von Zeiss. Auf ungeeigneten und auch älteren Objektträgern werden nicht selten Niederschläge mit gefärbt. Soll mit Immersion beobachtet werden, sollte das Öl vorher auf Tauglichkeit für die Fluoreszenzanregung geprüft werden.

5 µl der Gebrauchslösung wird mit einer sauberen Einweg-Pipettenspitze auf einen Objektträger getropft. Hierauf werden 25 µl der Probe mit den Ciliaten getropft ohne die Pipette in den Farbstoff einzutauchen (Verdünnung 1:5). Pipettenspitzen sind stets nur einmal zu verwenden, um gegenseitige Kontamination von Probe und Farbstoff zu vermeiden. Ich verwende stets zwei verschiedene Pipetten für Farbstoff und Probe. Wird eine neue Probe untersucht, dann ist eine neue Pipettenspitze zu verwenden. Hier besteht die Gefahr der wechselseitigen Kontamination der Proben mit fremden Ciliaten-Gemeinschaften. Enthält die Probe große Mengen an Bakterien oder Detritus, ist der Volumenteil des Farbstoffs ggf. zu erhöhen. Besser wäre die Ciliaten in diesem Fall zu vereinzeln und zu waschen, sofern sie dies vertragen.

Die mikroskopischen Präparate kommen nach dem Eindecken mit dem Deckglas in die feuchte Kammer. Die Färbedauer soll mindestens 3-4 Stunden oder über Nacht erfolgen.

Mikroskopische Beobachtung
Die Beobachtung erfolgt bei UV Anregung. Zur Anwendung kommen Filterwürfel mit Langpass Fluoreszenzfilter (Emission), die das gesamte Farbspektrum in der Emission zeigen. Die Anregungswellenlänge soll zwischen 360-390 nm liegen. Anregung mit LED ist bevorzugt.

Ich verwende anstelle eines gewöhnlichen UV Filtersatzes einen DAPI/FITC/TRITC Triple-Band-Filtersatz vom Typ F66-412 (Filterhersteller: Semrock), den man über die Firma AHF beziehen kann. Dieser Filtersatz erlaubt die Anregung mit mehreren Wellenlängen, nämlich UV (385 nm), Blau (470 nm) und Grün (550 nm). Ich verwende ihn für die Färbung lediglich mit jeweils einer Anregungswellenlänge (hier: UV-LED von Nichia, 385 nm). Der Filtersatz besitzt den Vorteil die intensive Autofluoreszenz von Chlorophyll zu unterdrücken, was bei der Beobachtung von Ciliaten mit Chlorellen oder gefressenen Algen wichtig ist.

Ergebnis
Hoechst 33342 stellt den Zellkern in blauer Farbe dar (Macronuclei, Micronuclei) und erlaubt daher eine genauere Bestimmung. Acridinorange färbt saure Organellen in grünen bis roten Farbtönen. Falls der Zellkern von Acridinorange gefärbt erscheint (was selten der Fall ist), kann der Zellkern auch in einer blaugrünen Mischfarbe erscheinen. Acridinorange färbt Granula und gelegentlich auch ciliäre Strukturen oder Extrusome (z.B. bei Paramecium). Bei einigen Gattungen, etwa Paramecium oder Spirostomum, kann man sehr schön auch die Bildung von Nahrungsvakuolen erkennen. Bei einigen Arten sind saure Organellen oder Granula der Mundregion bis ins Innere zu verfolgen. Der Vorteil dieser Färbemethode liegt in der Lebendfärbung. Die Individuen können über Stunden und Tage studiert werden. Auch die zeitliche Dokumentation der Kernstrukturen während Teilung oder Konjugation ist möglich.

Weitere Beispiele
Hier im Forum finden sich bereits einige Beiträge, die Ergebnisse mit dieser Färbung zeigen. Originalartikel
Bauer, T. Fluoreszenz-Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange zur Bestimmung der Arten von Ciliaten (Phylum: Ciliophora), Mikroskopie 1/2019, S. 2-19.

Weiterführende Literatur (Auswahl)
Bauer, T. Interpretation der Acridinorange-Färbung von Ciliaten (Ciliophora) des Süßwassers und des Bodens, Mikroskopie 1/2015, S. 23-35. Download des Artikels

Busch G. R., Satir B. H. The secretory vesicle in living Paramecium is acidic. J Cell Sci. 1989; 92: 197-203. Download des Artikels

Allen R. D., Fok A. K. Nonlysosomal vesicles (acidosomes) are involved in phagosome acidication in Paramecium. J Cell Biol. 1983; 97: 566-570. Download des Artikels

Kasten F. H. Cytochemical Studies with Acridine Orange and the Inuence of Dye Contaminants in the Staining of Nucleic Acid. In: Bourne, G. H., Danielli, J. F. International Review of Cytology Vol. 21. New York: Academic Press; 1967, pp. 141-202.
Dateianhänge
Paramecium_Phagosom.jpg
Paramecium_Two_Macronuclei.jpg
eMail: paramecium@microinformatics.net [Thilo Bauer]

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Pelagodileptus
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Re: Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange

#2 Beitrag von Pelagodileptus » 24. April 2019, 10:27

Hallo Thilo,

vielen Dank für die Ausführliche Darstellung der Doppelfärbung bei Ciliaten. Ich Färbe zwar auch, allerdings meist nur mit Acridinorange-Zinkchlorid, aber nicht mit einer durchgängigen Konsequenz, so wie Du es seit Jahren praktizierst. Und der Fluorochrome von Höchst (Ho342) kommt mir mit seiner Blaufärbung der Zellkerne bei der Bestimmung sehr entgegen... :wicked_015:

Danke nochmals für die kurze aber sehr Ausführliche Beschreibung,

Michael

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paramecium
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Re: Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange

#3 Beitrag von paramecium » 24. April 2019, 21:22

Hallo Michael,

die Färbung mit Acridinorange (AO-Zinkchlorid) ist eine spannende Sache. Ich hatte mir dieses Fluorochrom einst für den Anfang gekauft, weil es wirklich preiswert ist (meine Bezugsquelle: www.omikron-online.de). Ich kam darauf, als ich einen Artikel zur Kernfärbung von Ciliaten des Regenwurms im Mikroskosmos las. Die ersten Präparate habe ich hoffnungslos überfärbt. Das ergab aber genial gefärbte Paramecien in schrillen grün-roten Farben. Eine meiner ersten Aufnahmen finde ich heute in einem PDF der Hamburger Mikroskopiker wieder (man hat mich zwar weder gefragt, noch als Urheber benannt, aber es ehrt mich).

Die erhoffte Kernfärbung leistet der Farbstoff allzu oft jedoch nicht. Intakte, gesunde Zellen schaffen es leider einige Fluorochrome rasch wieder herauszupumpen (einige Autoren benennen diesen Effekt "Efflux Pump"). Selbst wenn der Kern gefärbt erscheint, beobachtet man bei den Ciliaten, dass er im Fluoreszenzlicht meist binnen Sekunden ausbleicht. Daher werden solche Fluorochrome in der Zytologie auch zur Detektion absterbender Zellen verwendet (=Apoptose). Das ist eines der Probleme, die es zu lösen galt.

Ich denke übrigens, dass auch das reine Acridinorange vergleichbare Ergebnisse produziert. Habe es aber nie probiert. Reines Acridinorange (freie Base) ist ein Vielfaches teurer, als das billige Doppelsalz, das man bei Omikron für knapp 6 EUR kaufen kann.

Viele Grüße

Thilo
eMail: paramecium@microinformatics.net [Thilo Bauer]

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paramecium
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Re: Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange

#4 Beitrag von paramecium » 26. Juli 2019, 19:07

Die Arbeit ist nun auch frei verfügbar:
Bauer, T. Fluoreszenz-Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange zur Bestimmung der Arten von Ciliaten (Phylum: Ciliophora), Mikroskopie 1/2019, S. 2-19.
eMail: paramecium@microinformatics.net [Thilo Bauer]

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ImperatorRex
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Re: Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange

#5 Beitrag von ImperatorRex » 12. September 2019, 20:48

Vielen Dank Thilo für Deinen faszinierenden Artikel.
viele Grüße
Jochen

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