welche Objektive oder unterstützende Techniken sind für Planktonproben von Vorteil?
In der Fachliteratur geistert immer wieder die Empfehlung bei der Erforschung wichtiger Details bestimmter Arten zu hohen Vergrößerungen mit der Öl-Immersion zu greifen, z.B. 100x Oil. Untermauert wird dies stets durch die notorischen Hinweise auch in der Amateurmikroskopie.
- Welche Objektive sind eigentlich für Plankton sinnvoll?
- Muss man immer zu speziellen Deckgläsern greifen?
- Warum bzw. ab wann liefern Trockenobjektive bei hohen Vergrößerungen ein schlechtes Bild?
- Wie kann man dem Problem unscharfer Abbildungen in Wasserproben begegnen?
Da Immersion-Öl in der Mikroskopie nahezu den gleichen Brechungsindex aufweist, wie Glas, hängt die Bildqualität beim Ölimmersionsobjektiv in diesem Fall nicht von der Dicke des Deckglases ab. Das Öl bildet mit dem Deckglas sozusagen eine optische Einheit mit annähernd gleichem Brechungsindex. Eine variable Schichtdicke des Öls kann jedoch zur Verschlechterung des Bildes beitragen, wenn die Öl-Immersion zweckentfremdet wird. Die Öl-Immersion ist eben nicht für Planktonproben gedacht. Auch Trockenobjektive leiden unter optischen Fehlern, weil sie nicht für den Blick in eine Planktonprobe mit hoher Wassersäule unter dem Deckglas gedacht sind, insbesondere die hohen Vergrößerungen (>40x). Dies will ich hier gerne näher ausführen und diskutieren.
Ein Experiment, das ich vor Jahren mit zwei verschiedenen Objektiven durchführte, ein leistungsfähiges Zeiss Trockenobjektiv Plan-Neofluar 40x/0,75 und ein modernes Zeiss Wasser-Immersionsobjektiv 40x/1,2 aus dem Forschungsbereich, immergiert mit einem Tropfen Wasser, ergab folgendes Bild von einer Alge im gleichen Präparat bei einer Wassersäule von ca. 150 µm (0,15 mm).
Abbildung: Unbearbeitete Abbildungen einer Grünalge mit einem Trockenobjektiv und einem Wasser-Immersionsobjektiv.
Nicht die höhere numerische Apertur des Multi-Immersionsobjektivs lieferte das bessere Ergebnis. Vielmehr haben wir es bei der Abbildung mit dem leistungsfähigen Trockenobjektiv mit einem optischen Fehler zu tun, der bei der Brechung der Lichtstrahlen bei höherer Wassersäule auftritt. Hier erfahren die Lichtstrahlen vom Objektiv ausgehend mehrere Übergänge, bei denen das Licht jeweils gebrochen wird: Glas-Luft-Glas-Wasser. Das Trockenobjektiv kann die unterschiedlich gebrochenen Lichtstrahlen, verursacht durch die Lichtbrechung bei unterschiedlicher Wassertiefe im Präparat, nicht kompensieren. Gelegentlich helfen dünnere Deckgläser (<0,17mm) diesen Umstand ein wenig abzufangen. Auch bei der Ölimmersion tritt eine Verschlechterung des Bildkontrasts mit zunehmender Wassersäule auf, durch die man hindurchblickt. Aber warum ist das so?
Das zu lösende Problem der Immersion ist die Vermeidung der sphärischen Aberration. Sphärische Aberration entsteht, wenn achsferne Lichtstrahlen abhängig von der Tiefe im beobachteten Medium (hier Wasser) divergieren und sich nicht mehr im gleichen Punkt (Objektebene) vereinen. Dieser Effekt führt dazu, dass bei Trockenobjektiven und auch(!) Öl-Immersions-Objektiven unterhalb des Deckglases die Bildqualität immer schlechter wird, je tiefer man in die Probe fokussiert. Das Bild wird flauer und kontrastärmer, auch Farbfehler werden auftreten, da immer mehr Lichtstrahlen stark divergieren und nicht mehr zum scharfen Bild beitragen. Der Effekt tritt um so stärker in Erscheinung, je höher die Vergrößerung wird, und wird mit dem Auge merklich etwa ab 40x wahrgenommen.
Abbildung: Erläuterung zur Entstehung der sphärischen Aberration bei Ölimmersion entnommen aus: Vermeulen, K. et al., 2006.
Gelöst wird dies, indem man Objektive so konstruiert, dass durchgängig, bei Verwendung eines Deckglases oberhalb und unterhalb des Deckglases, der gleiche Brechungsindex existiert, nämlich der Brechungsindex des untersuchten Mediums (z.B. Wasser), so dass die Lichtstrahlen ohne sphärische Aberration, quasi geradlinig vom Objektiv zum betrachteten Objekt laufen. Die Wasser-Immersion ist eine schon länger existierende Technik und in der Planktonbeobachtung eigentlich zu bevorzugen. Das Deckglas sollte hierbei eine bestimmte Dicke haben, jedoch ist bei erstklassigen Wasser-Immersions-Objektiven heute eine Möglichkeit der Einstellung der Deckglasdicke über einen Einstellring gegeben. Die Öl-Immersion ist für Präparate mit ähnlichem Brechungsindex des Einbettungsmediums zu wählen (z.B. Kanadabalsam, Kunstharze). Bei der Ölimmersion entfällt die Notwendigkeit der Kompensation der Dicke des Deckglases, weil Öl, Deckglas und das Einbettungsmedium näherungsweise den gleichen Brechungsindex aufweisen. Eine Sonderanwendung ist die gelegentlich angewandte Technik der Einbettung pflanzlicher Proben in Glyzerin, wofür man Immersion mit Glyzerin benötigt. Hier gilt das Gesagte wie für die Wasserimmersion (Brechungsindex des Mediums ungleich dem Brechungsindex von Glas).
Historisch entstand die die Idee der Wasserimmersion sogar vor der Ölimmersion. Damals war das belebte Wasser sehr interessant für die Forschenden. Es war Hartnack, um 1867, der solche Objektive erstmals auf der Weltausstellung in Paris präsentierte. In einem Schriftwechsel wurden diese Objektive von Charles Darwin lobend erwähnt. Auch andere, wie Louis Pasteur oder Robert Koch verwendeten damals die neuen Wasserimmersionsobjektive von Hartnack für bahnbrechende Forschung. Die Ölimmersion wurde interessanterweise später ersonnnen, und war für die Beobachtung eingedeckter Präparate in Harzen konzipiert, deren Brechungsindex sich von Wasser unterscheidet.
Die Anwendung von Ölimmersionobjektiven in der Beobachtung von Plankton ist ebensowenig ideal, wie die Verwendung von Trockenobjektiven. Daher gilt, dass Ölimmersion-Objektive nur in einer dünnen Schicht unterhalb des Deckglases ein klares Bild liefern. Je tiefer man in die Probe blickt, verschlechtert sich der Bildkontrast. Das Gleiche gilt ebenfalls für stärker vergrößernde Trocken-Objektive. Bei geringer Vergrößerung fällt der Effekt nicht so ins Auge ist aber auf Photos gut nachzuweisen. Daher funktionieren die hoch vergrößernden Trocken-Objektive (60x) ebenfalls nicht gut bei dicken Wasserschichten, sondern bestenfalls knapp unter der Unterseite des Deckglases. Dies wird vom Beobachter gelegentlich so empfunden, als würde das jeweilige Objektiv von schlechter Qualität sein, oder eben "launisch".
Ich habe mich vor kurzem mit einem Kollegen unterhalten (Mitarbeiter bei Zeiss) und ihn gefragt, wie es kommt, dass Ölimmersion noch immer in der Nachkriegsliteratur empfohlen ist. Historisch scheint die Wasser-Immersion in der Standardliteratur der Mikroskopie irgendwo zwischen oder nach den Weltkriegen verloren gegangen zu sein, oder sie fand nie Eingang, weil das Wissen zu Zeiten von Hartnack so alltäglich war, die genauere Theorie des Mikroskops jedoch noch nicht vollständig verstanden. Möglicherweise fehlt den Autoren von allgemeinen Handbüchern zur Mikroskopie tieferes Wissen über optische Fehler, oder sie ignorieren spezielle Hinweise in der Fachliteratur. Es ist überraschend, dass über Hartnack heute kaum etwas in der allgemeinen Literatur zu lesen ist. Erst Max Born verallgemeinerte die experimentellen Befunde zur mikroskopischen Auflösung nach Ernst Abbe in der elektro-magnetischen Theorie des Lichts und der Fouriermathematik. Viel Metall wurde zu seiner Zeit im 2. Weltkrieg für die deutsche Rüstung gesammelt und eingeschmolzen. Viele Mythen ranken sich um das Mikroskop, die heute noch der Aufklärung harren. So ganz konnten wir das nicht klären. Erst viele Jahre nach dem Weltkrieg werden wieder Wasser-Immersionsobjektive angeboten. Eventuell waren Ölimmersions-Objektive in der Histologie und klinischen Diagnostik eher wirtschaftlich. Um die 1990er wurden Multi-Immersionsobjektive konstruiert, die mit Wasser, Glyzerin oder Öl funktionieren. Sie sind ein guter Kompromiss um die Abbildungsfehler der Beobachtung im Medium Wasser zu kompensieren. Die Unterschiede im Brechungsindex des Mediums, in das man hineinblickt, werden über einen Einstellring kompensiert. Heute sind Life-Cell Imaging oder Super-Resolution Microscopy eng verknüpft mit hoch-gezüchteten Wasser- oder Multi-Immersionsobjektiven höchster Auflösung und ohne sie undenkbar. Mehr noch, diese Objektive haben ganz heimlich die Beobachtung lebender Zellen revolutioniert und das Lichtmikroskop in neue Dimensionen vordringen lassen.
Als sich mir die Gelegenheit bot, ein erstes Zeiss Multi-Immersionsobjektiv gebraucht zu erwerben, begann auch für den studierten Physiker der angewandten Optik ein neues Kapitel der Recherche zur Geschichte und Technik des Mikroskops. Der Wow-Effekt kann mit einem Satz zusammen gefasst werden ohne Übertreibung: "Endlich sehe ich etwas mit dem Mikroskop!". Ohne Beschränkung der Allgemeinheit möge das obige Bild als Beleg genügen.
Literatur:
- Blog-Artikel: Das launische Mikroskop mit Hinweisen zu Versuchen, wenn keine Wasser-Immersion zur Verfügung steht
- Vermeulen, K. et al., 2006. Optical trap stiffness in the presence and absence of spherical aberrations. Applied Optics 45(8):1812-9.
- S. Bradbury, 2014. Evolution of the Microscope. Elsevier.
Thilo
