Paramecium, Fluoreszenz Rhodamin 6g, Hoechst33342, Acridinorange

[spectrum]

Hallo Forum,
Da mich die Möglichkeiten mittels Fluoreszenzfarbstoffen einzelne Zellbestandteile in lebenden Mikroorganismen anzufärben sehr fasziniert, habe ich mich einmal an der Anfärbung mit Rhodamin 6G versucht.
Herhalten mussten dafür ein paar Exemplare meiner Paramecium caudatum Kultur, die ich nun schon seit mehreren Jahren erfolgreich kultiviere. Das Rhodamin 6G lag in einer 0.01%igen Lösung vor und wurde mit der Probe im Verhältnis 1:100 vermischt, also nochmals um den Faktor 100 verdünnt. In dieser Lösung verbrachten die Paramecien 2Tage im Kühlschrank bevor sie unter dem Mikroskop untersucht wurden.
Hier die Ergebnisse:

IMG_20250302_214736.jpg (209.16 KiB) 408 mal betrachtet

Nikon Fluor 40, Apertur: 1,3,
Blauanregung (450nm), Dichroid 510nm, Sperrfilter 530nm, Iso 6400, 1/50sec
Deutlich zu sehen sind die stark angefärbten Nahrungsbestandteile in den Vakuolen. Bei den körnigen Strukturen könnte es sich um Mitochondrien und/oder Strukturen des endoplasmatischen Retikulums handeln.
Herzliche Grüße Holger

[paramecium]

Hallo Holger,

meine eigenen Experimente der Darstellung der Mitochondrien an Paramecium spp. liegen schon eine Weile zurück. Ich habe es für Paramecium letztlich aufgegeben, weil die Rhodamine hier nicht funktionieren. Während man im Phako die Mitochondrien recht gut beobachten kann, sie haben generell einen anderen Brechungsindex, bewirkt die Färbung mit Rhodamin 6G oder Rhodamin 123 rein gar nichts bei dieser Gattung. Die beiden Rhodamine färben hier nach meiner Erfahrung nur sehr unspezifisch. Woran dies liegt, kann ich leider nicht sagen. Generell trifft dies auf einige getestete Ciliaten Spezies zu.

Die genannten Rhodamine gehören zu den Fluorochromen, bei denen die Intensität der Färbung abhängig vom Membranpotential der Mitochondrien ist. In der Fachliteratur wurden solche Färbungen bislang nur für wenige Ciliaten Gattungen, wie etwa Tetrahymena gezeigt.

Erfolge hatte ich bislang nur bei wenigen Gattungen, etwa einer noch zu beschreibenden Dexiotricha nov. sp. Hier zeigten sich langgezogene wurstförmige Mitochondrien. Das war eine Überraschung. Dieser Organismus ist ansonsten nur schlecht transparent. Im Hellfeld erscheint er mit anderen hochbrechenden Vesikeln gefüllt und ermöglich lichtmikroskopisch kaum Einblick in die Zellstruktur. Lichtmikroskopisch würde man D. nov. sp. wohl leicht mit D. granulosa verwechseln, auch mit dem DIC. Nur die Versilberung kann die Spezies dieser Gattung wirklich gut auseinander halten.

Bei Algen und Kieselalgen funktionieren die Rhodamine viel besser für eine Darstellung der Mitochondrien.

Gruß

Thilo

[spectrum]

Danke Thilo,
Für deine Erklärung und für den Tip das sich Algen besser mit Rh 6G anfärben lassen.
Die deutlichen Emmissionen in den Phagosomen sind wohl (Milchsäure) Bakterien. Hier bindet das Rhodamin auch recht gut.
Ich habe nach meiner (bescheidenen) bisherigen Erfahrung auch den Eindruck das sich gerade Paramecium caudatum auch mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen wie Acridinorange und auch Hoechst33342 weniger effektiv anfärben lässt als viele andere Mikroorganismen.
Paramecium bursaria oder Stentor coeruleus z.b. sind da, soweit ich das beurteilen kann, zumindest was AO angeht scheinbar deutlich affiner. Würde mich mal interessieren, ob das mit den Umweltbedingungen in denen P.caudatum lebt zu tun hat. Gegenüber Giften wie beispielsweise Alkohol der bei Gärprozessen entsteht und verschiedenen Elektrolytzusammensetzungen ist P.caudatum ja wohl auch besonders robust.
Abgesehen von der grün bis gelben Fluoreszenz des Rh 6G habe ich übrigens auch blaue Fluoreszenzemissionen unter UV Anregung bei dem gezeigten Exemplar beobachten können.
Hier mit 365nm Anregung und 440nm Langpasssperrfilter:

IMG_20250303_080746.jpg (232.04 KiB) 360 mal betrachtet

Das Cytoplasma des Parameciums war hier schon kurz vor der Aufnahme, aufgrund der UV Strahlung ausgelaufen. Die blauen Bereiche waren aber auch im intakten Zustand zu sehen.
Worum handelt es sich da?
Deine Dexiotricha Ausführungen sind ja sehr interessant. Überhaupt finde ich es sehr spannend wie unterschiedlich sich einzelne Arten in der Fluoreszenzmikroskopie verhalten.
LG Holger
P.s.: Den vermutlich zu Oxytrichidae gehörenden Cilliaten über den es bereits einen Beitrag gibt konnte ich inzwischen erfolgreich aus eingetrockneten Proben wiederbeleben.
Jedoch hält er sich offensichtlich nur in den Petrischalen in denen auch Stephanosphaera vorkommt über längere Zeit. Da scheint es einen Zusammenhang zu geben.
Aber dazu schreibe ich dann nochmal gesondert.

[spectrum]

Hallo Holger,

neben der Fähigkeit der Membranen verschiedener Zellorganellen bestimmte Substanzen zu blocken, gibt es in der Fachliteratur einen Effekt, der unter der Bezeichnung "Efflux Pump" bekannt ist. Der Begriff bildet eine Klammer um die Fähigkeit der Zellen (auch Bakterien) gewisse Fremdstoffe aus dem Zellinneren oder auch einzelnen von Membranen umschlossenen Organellen fernzuhalten, hier gewissermaßen wieder herauszupumpen. Hierzu zählen auch Fluorochrome. Einige Fluorochrome werden mit Carbonsäuren verestert. Dadurch werden die Membranen gewissermaßen blind gegenüber den Markern und lassen diese passieren. Neben solchen einfachen Sperren in den Membranen gibt es weit komplexere Effekte, die bis hin zu Resistenzen gegenüber Antibiotika bei den Bakterien führen.

Gewöhnlich diffundieren diese Stoffe in der Lösung, und sollten sich so auch in der Zelle zunächst frei verteilen, können jedoch manche Membranen nicht passieren. Acridinorange gehört zu den Stoffen, die bestimmte Membranen passieren und dann im sauren Milieu umgeladen die gleiche Membran umgekehrt passieren können. Dieser Effekt führt im Gegensatz zu Markern zu einer zunehmenden Konzentration in sauren Organellen. Ähnlich verhält es sich eventuell mit einigen Rhodaminen. Rhodamin B färbt beispielsweise in ähnlicher Weise saure Organellen, wie Acridinorange. Das lässt sich sehr schön in einer Mischfärbung klären, wobei AO grün und Rhodamin rot leuchtet. Betrachtet man die Farbkanäle einer solchen Farbaufnahme, findet man, dass beide Farbstoffe die sauren Organellen von Paramecium färben.

Die spezifischen Fluorochrome sind eher Kombinationen von Fluorophoren und speziellen Markern, die mit anderen Stoffen eine Bindung eingehen können, die sie so nachweisen. Das geht bis zu den Antikörpermarkern. Manche Marker können lebende Zellen gar nicht passieren und funktionieren erst nach der Fixierung der Zellen (lethal). In der Zytologie macht man sich solche Eigenschaften zu nutze, um apoptotische Zellen (=programmierter Zelltod) oder Krebszellen von lebenden bzw. "gesunden" Zellen zu trennen, etwa in Zellsortern. Das Sortierkriterium ist die Intensität der Färbung. Einfach ausgedrückt: Gut gefärbt = verdächtig, krank, durchlässig für die Fluorochrome. Schlecht gefärbt = gesund. Auch die Hoechst-Farbstoffe sind Beispiele, die von Zellen nicht einfach absorbiert werden und so in speziellen Verfahren auch gezielt als Indikator lebend-tot genutzt werden.

Vielfach hat sich eine längere Inkubation in der feuchten Kammer bewährt, um Färbungen besser darzustellen. Das habe ich aus gutem Grund bereits in meinen Artikeln beschrieben. Inkubationszeiten sollten mindestens 30 Minuten, besser einige Stunden betragen. Dies hat auch einen weiteren Nebeneffekt: Die Zellen sind nach dieser zeit weniger gestresst und gegenüber dem hellen Fluoreszenzlicht weniger empfindlich. Diese Lichtempfindlichkeit durch Streß erhöht die Mortalität der Zellen, wie auch die Neigung dem hellen Fluoreszenzlicht zu entfliehen.

Wie das genau wirkt, kann ich Dir nicht genau sagen. Die Zellbiologie erscheint zu komplex. Aber ich habe beobachtet, dass frisch gefärbte Präparate auch dazu führen können, dass die Ciliaten unter Lichteinfluss regelrecht zerfallen können. Nach längerer Inkubationszeit sind sie weniger anfällig dafür und auch ruhiger und fliehen nicht sofort aus dem beleuchteten Bereich.

Ich habe schon Ciliaten mit Hoechst gefärbt fotografiert, bei denen vermutlich Parasiten (Bakterien) besser gefärbt erschienen, als der Zellkern. In zwei anderen Fällen habe ich nach dem Zerplatzen eine abrupt auftretende deutliche Blaufärbung des Zytoplasmas beobachtet, was auf pathogene Viren DNA hinweisen könnte, Ciliatenschnupfen. Gesundheit! Rein theoretisch sollte auch mitochondriale DNA mit Hoechst gefärbt werden können. Dies habe ich noch nicht mit Sicherheit beobachten können. An fixierten Zellen ist das vielleicht möglich.

Viele Grüße

Thilo

[spectrum]

Hallo Thilo,
Danke für diese umfangreiche Antwort!
Dein Text ist ja vollgepackt mit interessanten Informationen...
Da ist einiges dabei das ich erstmal "sacken" lassen muss.
Ich hab zwar bisher noch nicht so sehr viel Erfahrung mit der Fluoreszenzfärbung lebender Einzeller sammeln können, aber einige Dinge die Du in vorherigen Beitrag beschreibst, decken sich auch mit meinen bisherigen Beobachtungen. Lange Einwirkzeiten führen definitiv zu besseren Ergebnissen, sowohl was die Differenzierung, als auch die Intensität angeht. Teilweise glaube ich sogar, dass die Färbung sogar bei Einwirkzeiten von mehreren Tagen immer noch besser wird.
Acridinorage ist bei kurzer Einwirkzeit, besonders toxisch, dass merkt man deutlich. Allerdings sind dann aber die Zellkerne besser sichtbar als nach längeren Einwirkzeiten, so mein Eindruck.
Das hängt dann wohl mit dem Effekt der sich "Efflux Pump" nennt zusammen.
Überhaupt habe ich bei Acridinorange oft ganz unterschiedliche Ergebnisse. Selbst bei gleichem Protokoll, manchmal selbst bei verschiedenen Individuen innerhalb ein und derselben Probe.
Danke für deine Ausführungen, das wäre eine Erklärung warum das so ist.
Spannend und immer wieder hochinteressant ist das Thema auf jeden Fall.
Zuguterletzt scheint bei AO dann auch noch der phWert eine große Rolle zu spielen. Bereits nur leicht ins basische Millieu verschobe Proben sind oft besser differenziert.
Von den verschiedenen Hoechst Farbstoffen kenne ich nur Ho33342. Der färbt bisher sehr zuverlässig, und scheint auch in weit höheren Dosen als in deinem Färbeprotokoll für die Doppelfärbung, die gefärbten Einzeller kaum zu beeinträchtigen. Welche anderen Hoechst Farbstoffe sind denn lohnende Alternativen?
Und was erreicht man mit Dapi, im Vergleich?
Ich hoffe ich übertreibe es nicht mit meiner Neugier, aber das Thema fasziniert mich wirklich sehr.
LG Holger

[paramecium]

Hallo Holger,

typischerweise sollten die Fluorochrome in der Konzentration von wenigen µM angewandt werden. Wenn AO toxisch wirkt, dann ist das ein Hinweis auf Überdosierung. Ich lese oft in den Forem, dass AO in der im Romeis abgedruckten Dosierung verwendet wird (1:10.000). Das ist eine zu hohe Konzentration und bestenfalls als Stammlösung für die weitere Verdünnung (1:100) zu verwenden.

Dass meine Wahl bei der Doppelfärbung auf Ho342 fiel, kommt nicht von ungefähr. Zu den Hoechst Farbstoffen und DAPI gibt es einige Veröffentlichungen, die sich mit der Frage der Färbung bei lebenden Organismen beschäftigen. Die Quintessenz: Ho342 ist für diesen Anwendungsfall am besten geeignet, färbt nach eigenen Erfahrungen jedoch auch fixierte Präparate sehr gut: DNA Färbung von getrockneten Chironomus Larven. Ich habe die Quelle(n) ich in meinem Artikel zitiert.

Gruß

Thilo

[spectrum]

Hallo Thilo,
Erneut vielen Dank für das weitere Input. Was die Konzentration des Acridinorange angeht, halte ich mich inzwischen schon länger aus genau den angeführten Gründen an dein Protokoll. Mit der erwähnten Toxizität bei kurzen Einwirkzeiten meine ich genaugenommen die Phototoxizität, ich habe mich da ungenau ausgedrückt.
Hoechst33342 kann man aber, so meine Erfahrung, ohne weiteres höher dosieren als in der beschriebenen 27 μM Konzentration, ohne Nachteile in Kauf nehmen zu müssen. Mir hat das geholfen den Zellkern von P. bursaria im Vergleich zu der starken Autofluoreszenz des Chlorophylls "heller" zu bekommen. Ich hab ja keinen Tripelfiltersatz der die Autofluoreszenz des Chlorophylls unterdrücken kann.
Hat für mich funktioniert.
Um aber nochmal auf die Mitochondrien-Färbung bei Paramecium zurückzukommen, kann man da vielleicht mit der Zugabe von Na+ oder anderen Kationen in der Kulturlösung, das Membranpotenzial in der Zelle gezielt beeinflussen?
Beste Grüße Holger

[paramecium]

Hallo Holger,

es gibt zu solchen Versuchen mit dem mitochondrialen Membranpotential eine Vielfalt von Literatur und auch Versuchen mit Ciliaten. Die meisten natürlich auf englisch. Eine Google Suche führt Dich etwa zu Versuchen mit verschiedenen Teesorten für Tetrahymena, bei denen man u.a. Oolong Tee verwendete. Schwarzer tee oder Kaffee dürfte auch funktionieren. Auch Cannabinoide hat man untersucht.

Bei Ciliaten Familien, wie Tetrahymena und verwandten Gattungen, färben die Mitochondrien recht gut und man hat mehr Erfolg mit den Färbungen. Einige Glockentierchen, wie C. polypinum sind auch gute Kandidaten.

Paramecium ist der denkbar schlechteste Kandidat für solche Experimente.

Viele Grüße

Thilo

[spectrum]

Hallo Thilo,
Bei der erneuten Durchsicht Aufnahmen der mit Rhodamin 6G angefärbten Paramecien ist mir auf einigen Bildern etwas aufgefallen das mich stutzig macht.
In dem Bereich in dem sich bei caudatum der (einzelne) Micronucleus befinden sollte, sieht man dort eine Struktur die nach mehreren kleineren Micronuclei aussieht:

IMG_20250325_122324.jpg (158.66 KiB) 104 mal betrachtet

Eventuell könnte es sich dann auch um eine andere Art handeln, oder?
Kann man dazu anhand der gezeigten Aufnahme überhaupt eine Aussage machen?
Grüße Holger

[paramecium]

Hallo Holger,

Rhodamin 6G ist für einen Nachweis der Zellkerne nicht geeignet, färbt jedoch unspezifisch saure Organellen in der Zelle, etwa Phagosome (Nahrungsvakuolen) oder saure Vesikel (Acidosome, Lysosome). Die gezeigten "Hohlräume" lassen nur darauf schließen, dass sich hier weniger gefärbte saure Vesikel befinden. Etwa die beiden pulsierenden Vakuolen, neben denen auch andere "Hohlräume" zu sehen sind. Mehr können wir hieraus nicht schließen.

Kernfiguren einiger Arten habe hier abgebildet für P. caudatum oder P. aurelia. Belege für eine weitere in Kultur gehaltene Art, nämlich P. calkinsi reiche ich noch nach.

Viele Grüße

Thilo

[spectrum]

Danke dir Thilo,
Die Bilder mit Hoechst33342 Färbung, sind genau das was ich suche. Dann werde ich es bei Gelegenheit einmal damit versuchen. Weitere Kernfiguren zu verschiedenen Paramecium Arten habe ich hier gefunden:

https://www.semanticscholar.org/paper/P ... c0684?p2df

Melde mich, Grüße Holger

[paramecium]

Hallo Holger,

diesen Artikel zur Bestimmung von Paramecium habe ich vor einiger Zeit auch hier im Forum übersetzt und zu früheren Artikeln auch anderer fleißiger Beobachter hier verlinkt.

Während und nach Konjugationen findet man allerdings auch solch kuriose Kernfiguren, wie die Teilungen der Micronuclei und eine Aufteilung des Macronucleus, der nach einer Konjugation über mehrere Teilungen hinweg allmählich erst wieder zusammenwächst. Hier habe ich früher einmal eine Beobachtung dokumentiert, bei der die Teilung der Micronuclei während der Konjugation im richtigen Moment erfasst wurde: Teilung des Micronucleus von Paramecium sp. während der Konjugation.

Viele Grüße

Thilo

[spectrum]

Hallo Thilo,
Super, das hilft weiter.
Fortsetzung folgt.
Viele Grüße Holger

[spectrum]

Hallo,
Hier die Bilder der Paramecien mit Hoechst33342.
Mir steht zur Zeit leider nur noch eine kleine Restmenge an Hoechst33342 zur Verfügung, die eine exakte Dosierung leider nicht mehr möglich macht. Ich denke aber das die entstandenen Bilder und das Video trotzdem ausreichend Information enthalten könnten, um Aussagen über die genaue Art zu machen. Für mein Verständnis und mit der mir zur Verfügung stehenden Informationen, halte ich Paramecium caudatum für zutreffend.

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Was sagst du Thilo?

Ein Video dazu gibt es auch:

https://youtu.be/u5PxeqaaJvc?si=GitBA80fGUjgoYGz

Grüße Holger

[spectrum]

Hi,
Es gibt weitere Neuigkeiten von meiner Paramecienkultur. Nachdem ich diesmal mit Hoechst33342 und Acridinorange doppelt gefärbt hatte, fiel mir ein deutlicher Größenunterschied einzelner Individuen auf:

IMG_20250328_130942.jpg (127.85 KiB) 6 mal betrachtet

Ein Video gibt es auch:
https://youtu.be/peOTzDLPti0?si=Xnk83LUzdpD7PxRQ

P.s. Ich hab auch mal den Titel des Beitrags editiert.